Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax
Summary
Este protocolo permite la visualización de la expresión génica en embrionario Astyanax cavefish. Este enfoque ha sido desarrollado con el objetivo de maximizar la señal de la expresión del gene, minimizando tinción de fondo inespecífica.
Abstract
En los últimos años, se ha publicado un genoma de proyecto para el cavefish mexicano ciego (Astyanax mexicanus), revelando las identidades de la secuencia de miles de genes. Investigaciones anteriores en este sistema de modelo emergente capitalizan completo genoma las investigaciones que han identificado numerosos loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados con diversos fenotipos asociados de cueva. Sin embargo, la capacidad de conectarse a genes de interés a la base hereditaria para cambio fenotípico sigue siendo un desafío significativo. Una técnica que puede facilitar la comprensión del papel del desarrollo en evolución troglomórphico es todo montaje hibridación in situ. Esta técnica puede implementarse directamente comparar la expresión génica entre las formas de vivienda de la cueva y la superficie, nominar a candidato genes subyacentes QTL establecido, identificar los genes de interés de los estudios de secuenciación de próxima generación, o desarrollar otros enfoques basados en el descubrimiento. En este informe, presentamos un protocolo simple, apoyado por una lista flexible, que puede ser ampliamente adaptada para su uso más allá del sistema de estudio presentados. Se espera que este protocolo puede servir como un recurso amplio para la comunidad de Astyanax y más allá.
Introduction
Hibridación in situ es un método común para la tinción de tejidos fijos para visualizar patrones de expresión de gen1. Esta técnica se ha realizado durante años en otros tradicionales2 y sistemas no tradicionales3 modelo para una variedad de estudios biológicos. Sin embargo, varios pasos y los reactivos son necesarios para realizar exitosamente este procedimiento. Para los investigadores que nunca han realizado esta técnica, iniciando el proceso puede ser intimidante debido a los muchos pasos necesarios. Además, la larga naturaleza de este procedimiento se presta a errores técnicos, que pueden ser difícil solucionar problemas.
El objetivo general de este artículo es presentar un método simple y sencillo que se puede representar esta técnica de hibridación accesible a un público más amplio. Para reducir la introducción de errores, presentamos un enfoque sencillo que produce alta calidad gene expresión manchas y reduce al mínimo la señal de fondo no específicas. Este procedimiento es similar a otros enfoques desarrollados en los sistemas de modelo tradicional, como Danio rerio4. Aquí, nuestro objetivo es facilitar la aplicación cuidadosa de cada paso usando una lista descargable (1 archivo suplementario), para promover el cuidado de aplicación del protocolo. La justificación para hacer esto es para facilitar la organización a través de los muchos pasos implicados en este procedimiento. Este artículo es apropiado para los investigadores interesados en realizar la hibridación in situ de montaje en conjunto en el desarrollo de embriones, pero aún no han realizado el procedimiento. La ventaja del enfoque elegido por los investigadores de Astyanax es que ha sido probado y comprobado en cavefish y morfos de peces de superficie, facilitando así el análisis comparativo de la expresión. El método presentado puede utilizarse por los investigadores en estudios sobre Astyanax y otros sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a la vulnerabilidad del ARN a la degradación, uno de los pasos más importantes en el protocolo refiere a la síntesis estéril de la sonda de RNA. Sin embargo, si una sonda se genera con cuidado y proporciona buenos resultados, pueden ser reutilizado en posteriores reacciones de tinción. Un segundo paso crucial es la cuidadosa producción de todos los reactivos utilizados en el protocolo. Puesto que este protocolo trata de varios días y muchos pequeños pasos, es esencial que todos los reactivos son exactament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de bruto para comentarios de este manuscrito. Queremos reconocer a cuatro estudiantes de secundaria que utilizan este protocolo durante las pasantías de verano en 2017 y 2018, incluyendo Christine Cao, Michael Warden, Aki Li y David Nwankwo. HL fue apoyado por una beca de madre de Biología UC durante el verano de 2017. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Science Foundation (DEB-1457630 a la JBG) y el institutos nacionales de Dental e investigación craneofacial (NIH; DE025033 a la JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
References
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