Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish
Summary
Мы описываем подходы для манипулирования генов в системе Эволюционная модель Астианакт гракл. Описываются три различных методов: Tol2-опосредованной трансгенез, целенаправленные манипуляции генома используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и сногсшибательно выражения с использованием морфолиновая. Эти инструменты должны облегчить прямое расследование генов, лежащие в основе различия между формами поверхности и пещера жилище.
Abstract
Пещерных животных обеспечивают убедительные системы для изучения эволюции механизмов и генетических основ лежащих в основе изменений в многочисленных сложных черты, включая глаз дегенерации, альбинизм, потеря сна, hyperphagia и сенсорной обработки. Виды cavefish от всего мира отображения конвергентной эволюции морфологических и поведенческих признаков из-за общих экологических проблем между различными пещерных систем. Были изучены различные пещеры видов в лабораторных условиях. Мексиканский tetra, гракл Астианакт, с нормальным зрением и слепых форм, предоставила уникальные идеи в молекулярных и биологических процессов, лежащих в основе эволюции сложных черты и хорошо готовы как формирующейся модели системы. В то время как в A. гракл был выявлен кандидат генов, регулирующих эволюцию различных биологических процессов, возможность проверки роли для отдельных генов был ограниченным. Приложение трансгенез и Джин редактирования технология имеет потенциал для преодоления этого значительные препятствия и изучить механизмы, лежащие в основе эволюции сложных черты. Здесь мы описываем различные методологии для манипулирования экспрессии генов в A. гракл. Подходы включают использование морфолиновая, Tol2 трансгенез, и Джин редактирования системы, часто используемые в данио рерио и другие рыбы модели, чтобы манипулировать функции гена в A. гракл. Эти протоколы включают подробные описания процедур приурочен разведения, коллекции оплодотворенные яйца, инъекции и отбора генетически модифицированных животных. Для исследования генетических и нейронных механизмов, лежащих в основе эволюции различных признаков в A. граклпозволит эти методологические подходы.
Introduction
С тех пор Происхождение видовДарвина1ученые получили глубокое понимание как черты эволюционно формируются в ответ на определенные природоохранные и экологические давление, благодаря пещера организмов2. Мексиканский tetra, A. гракл, состоит из глазами предков «поверхности» популяций, которые населяют рек Мексики и Южной Техас и по крайней мере 29 географически изолированные популяции производных пещера морф, населяющих Abra Сьерра-дель- и другие районы северо-восточной Мексике3. Было выявлено несколько черт, связанных пещера в A. гракл, включая потребление кислорода изменены, депигментация, потерю глаза и изменили кормления и нагула поведение4,5,6, 7,8,9. A. гракл представляет мощную модель для изучения механизмов конвергентной эволюции благодаря четко определенной эволюционной истории, подробная характеристика состояния окружающей среды и присутствие независимо эволюционировали пещера населением в10,11. Многие из пещеры производные признаки, которые присутствуют в cavefish, включая потерю глаз, потеря сна, увеличилось, питание, потеря школьного обучения, снижение агрессии и уменьшить стресс ответы, развивались несколько раз через независимого происхождения, зачастую с использованием различные генетические пути между пещеры8,12,13,14,15. Это повторяется, эволюция является мощным аспектом A. гракл системы и может обеспечить проницательность в более общий вопрос о как генетических систем может возмущенных для создания аналогичных фенотипов.
В то время как в многих видов рыб (в том числе A. гракл) был ограниченным применения генетических технологий механистический расследования функции гена, последние достижения в zebrafish обеспечивают основу для разработки генетических технологий в рыбе 16,17,18,19,20. Многочисленные инструменты широко используются в zebrafish манипулировать экспрессии генов, и осуществление этих процедур давно были стандартизированы. К примеру инъекции oligos Морфолино (MOs) на стадии одноклеточных выборочно блокирует РНК и предотвращает перевод для краткое временного окна во время разработки21,22. Кроме того, ген редактирования подходы, такие, как кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) / ТРИФОСФАТЫ, связанные белком 9 (Cas9) и транскрипции активатор как эффекторных нуклеиназы (TALEN), позволяют для генерации определенных исключений или, в некоторых случаях, вставки через рекомбинации в геномах19,,2023,24. Трансгенез используется для манипулирования стабильной ген выражение или функцию определенным образом тип ячейки. Система Tol2 эффективно используется для создания трансгенных животных, coinjecting Транспозаза мРНК с Tol2 плазмида ДНК, содержащие трансген25,26. Система Tol2 использует Tol2 Транспозаза оризии для создания стабильной микрофлорой вставки трансгенных construct17. Создание Tol2 мутация включает в себя coinjecting плазмиды, содержащий трансген, обрамленная Tol2 интеграции сайтов и мРНК Tol2 Транспозаза17. Эта система используется для создания массива трансгенных линий в данио рерио и его использование недавно расширена еще формирующейся модели систем, включая цихлид, Пецилиевые рыбы, колюшка и, более недавно, мексиканской cavefish27, 28,29,30.
В то время как cavefish это увлекательный биологическая система для разъяснения механизмов черта эволюции, его потенциал как Эволюционная модель не были использованы полностью. Это частично объясняется невозможностью манипулировать генетических и сотовой функция непосредственно31. Кандидат генов, регулирование сложных черты были определены с использованием количественных признаков локусов (QTL) исследования, но проверка этих генов кандидат был трудным32,33,34. Недавно переходных нокдаун, используя морфолиновая, Джин, редактирование с помощью систем ТРИФОСФАТЫ и TALEN и использование Tol2-опосредованной трансгенез были использованы для изучения генетической основы, лежащие в основе ряда признаков35,36,37 ,38. Осуществление и стандартизации этих методов позволит для манипуляции, которые допрашивают молекулярных и нейронных основы биологических черт, в том числе манипуляции функции гена, маркировки определенных клеточных популяций, и выражение функциональных репортеров. Успешное осуществление этих генетических инструменты для манипулирования генов или сотовой функция была продемонстрирована в формирующейся модели систем, в то время как в A. граклпо-прежнему отсутствуют подробные протоколы.
A. гракл обеспечивают критический взгляд в механизмы эволюции в ответ на меняющиеся условия и возможность для определения новых генов, регулирующих различные черты. Ряд факторов предполагают, что A. гракл является чрезвычайно шансов справиться с возникающими модель для применения установленных геномной инструментов, имеющихся в настоящее время в установленные генетические моделей, включая возможность легко поддерживать рыбы в лабораториях, большой размер выводка, прозрачности, последовательности генома и определенных поведенческих анализов39. Здесь мы описываем методологии для использования морфолиновая, трансгенез и Джин редактирования в поверхность и пещера популяциях A. гракл. Более широкое применение этих инструментов в A. гракл позволит механистический расследование молекулярных процессов, лежащих в основе эволюции развития, физиологические и поведенческие различия между cavefish и поверхности рыбы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставили методологию для манипулирования функции гена, используя морфолиновая, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования и трансгенез методологии. Богатство генетических технологий и оптимизации этих систем в данио рерио, скорее всего, позволит для передачи этих средств в A. г?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Sunishka Тхакур за ее помощь в генотипирования и визуализации oca2 мутант рыб, изображенный на рисунке 2. Эта работа была поддержана Национальный фонд науки (NSF) награду 1656574 A.C.K., премии 1754321 NSF J.K. и A.C.K. и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) премии R21NS105071 A.C.K. и E.R.D.
Materials
| Fish breeding & egg supplies | |||
| Fine mesh fish net | Penn Plax | BN4 | |
| Fish tank heater | Aqueon | 100106108 | |
| Egg traps | Custom made | NA | Design and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs |
| Glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette bulbs | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Egg molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Standard control olio | |
| Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Phenol Red | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| CRISPR supplies | |||
| Cas9 Plasmid | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA Polymerase | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primers | Integrated DNA Technologies | Custom | |
| T7 Megascript Kit | Ambion/Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmid | Kawakami et al., 2004 | Request from senior author | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme | New England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection supplies | |||
| Glass Capillary Tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micromanipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Steel Plate Base, 10 lbs |
References
- Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
- Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
- Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
- Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. 발생학. , (2018).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
- Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
- Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. 유전학. 174 (2), 639-649 (2006).
- Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
- Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
- Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
- Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
- Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
- Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. 발생학. , (2018).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
- Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
- Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. 발생학. 227 (2), 279-293 (2000).
- Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
- Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
- Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
- Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
- Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
- Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. 발생학. , (2018).
