Высок объём Assay для прогнозирования химической токсичности путем автоматизированного фенотипические профилирование Caenorhabditis elegans
Summary
Количественный метод был разработан для выявления и прогнозирования острой токсичности химических веществ, автоматически анализируя фенотипического профилирование Caenorhabditis elegans. Этот протокол описывает, как для лечения червей с химическими веществами в 384-ну пластине, захвата видео и количественно токсикологические связанных фенотипов.
Abstract
Применяя тестирование токсичности химических веществ в высших организмов порядка, такие как мышей или крыс, длительным и дорогостоящим, из-за их долговечность и проблемы обслуживания. Напротив, нематоды Caenorhabditis elegans (C. elegans) имеет преимущества, чтобы сделать его идеальным выбором для тестирования токсичность: эффективное воспроизведение короткий срок и легко культивирования. Здесь мы описываем протокол для автоматического фенотипические профилирования C. elegans в 384-ну пластине. Черви нематоды культивировали в 384-ну плита с жидким средних и химические лечения, и видео взяты из каждой скважины для количественного определения химического влияния на 33 особенности червя. Экспериментальные результаты показывают, что количественных фенотип функции можно классифицировать и предсказать острой токсичности для различных химических соединений и создать список приоритетных для дальнейших испытаний оценки традиционных химическая токсичность в модели грызунов.
Introduction
Наряду с быстрым развитием химических соединений, для промышленного производства и повседневной жизни людей важно для изучения токсичности тестирования моделей для химических веществ. Во многих случаях грызун животную модель используется для оценки потенциальной токсичности различных химических веществ на здоровье человека. В целом определение концентраций смертельной (т.е. Оксиметрический анализ 50% смертельная доза [ЛД50] различных химических веществ) используется в качестве параметра традиционной модели грызунов (крысы/мыши) в естественных условиях, которая является длительным и очень дорого. Кроме того вследствие сокращения, уточнить, или заменить (3R) принцип, который имеет центральное значение для благополучия животных и этики, новые методы, которые позволяют замену высших животных являются ценными для научных исследований1,2,3 . C. elegans это Свободноживущие нематоды, который был изолирован от почвы. Он широко используется как организм исследований в лаборатории из-за его полезных характеристики, такие как эффективное воспроизведение короткий срок и легко культивирования. Кроме того многие основные биологические пути, включая основные физиологические процессы и реакции стресса в C. elegans, сохраняются в высших млекопитающих4,5,6,7 , 8. в нескольких сравнений, сделали мы и другие, есть хороший конкорданцию C. elegans токсичности и токсичности в грызунов9. Все это делает C. elegans хорошая модель для проверки эффектов химической токсичности в естественных условиях.
Недавно некоторые исследования количественно Фенотипические особенности C. elegans. Функции могут использоваться для анализа токсичности химических веществ2,3,10 и старение червей11. Мы также разработали метод, который сочетает в себе жидкого червь, культивирования и системы анализа изображений, в котором червей культивировали в 384-ну плита под12различных химических обработок. Этот количественный метод был разработан для автоматически анализировать 33 параметры C. elegans после 12-24 ч химической обработки в 384-ну плита с жидкой среды. Автоматизированный микроскопа используется для экспериментальных видео приобретения. Видео обрабатываются программой специально, и количественно 33 особенности, связанные с движущейся поведение червей. Этот метод используется для количественного определения червь фенотипов под лечения 10 соединений. Результаты показывают, что различные токсичность может изменить фенотипов C. elegans. Эти количественные фенотипов может использоваться для выявления и прогнозирования острая токсичность различных химических соединений. Общая цель этого метода заключается в содействии наблюдения и фенотипические количественной оценки экспериментов с C. elegans в жидком культуры. Этот метод полезен для применения C. elegans в оценках токсичности химических и фенотип количественной, которые помогают предсказать острая токсичность различных химических соединений и создать список приоритетных для дальнейшего традиционных Химическая токсичность оценки тестов в модели грызунов. Кроме того этот метод может применяться к токсичности скрининг и тестирование новых химических веществ или соединения как пищевой добавки агент загрязнения, pharmacautical соединений, экологические внешние соединения и так далее.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества C. elegans привели к его рост использования в токсикологии9, как механистической исследований и высокопроизводительного скрининга подходов. Повышение роли C. elegans дополняя другие модели систем в токсикологических исследований был замечательным в послед…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят CGC за любезно отправки C. elegans. Эта работа была поддержана национальной ключ научных исследований и развития программа Китая (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705); Фонд национальной естественных наук Китая Грант (#31401025, #81273108, #81641184), столицы медицинских исследований и разработка специального проекта в Пекине (#2011-1013-03), открытие Фонда Пекин ключевых Лаборатория экологической токсикологии (# 2015HJDL03) и фонд естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2017BF041).
Materials
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 59300 | |
| 384-well plates | Throme | 142761 | |
| Agar | Bacto | 214010 | |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | PHL80892 | |
| Bleach buffer | 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water | ||
| Cadmium chloride | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | |
| CCD camera | Zeiss | AxioCam HRm | Zeiss microscopy GmbH |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Copper(II) sulfate | Sigma-Aldrich | 451657 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 24105 | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| K-Medium | 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water | ||
| LB Broth | 10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| NGM Plate | 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer | ||
| Peptone | Bacto | 211677 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 60130 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 795496 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| PPB buffer | 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water | ||
| shaker | ZHICHENG | ZWY-200D | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | s7920 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 239305 | |
| The link of program | https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate | ||
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | |
| Zeiss automatic microscope | Zeiss | AXIO Observer.Z1 | Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera |
References
- Anderson, G. L., et al. Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).
- Boyd, W. A., et al. A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay. Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).
- Boyd, W. A., Williams, P. L. Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests. Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).
- Dengg, M., van Meel, J. C. Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).
- Schouest, K., et al. Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).
- Sprando, R. L., et al. A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media. Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).
- Wang, D., Xing, X. Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).
- Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).
- Li, Y., et al. Correlation of chemical acute toxicity between the nematode and the rodent. Toxicology Research. 2 (6), 403-412 (2013).
- Boyd, W. A., et al. Effects of genetic mutations and chemical exposures on Caenorhabditis elegans feeding: evaluation of a novel, high-throughput screening assay. PLoS One. 2 (12), 1259 (2007).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Gao, S., et al. Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18 (2018).
- Moyson, S., et al. Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).
- Wang, X., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).
- Boyd, W. A., et al. Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits. Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).
