처리 및 인간의 기본 전립선 Organoid 문화에 대 한 평가

다음 프로토콜은 일리노이 대학 시카고 병원에서 환자의 조직에서 수확 인간의 기본 전립선 상피 세포를 사용 하 여 최적화 되었다. 이 실험을 위해 사용 하는 모든 인간의 조직 프로토콜 인수를 통해 기관 검토 위원회 승인 및 시카고에 일리노이의 대학에서 면제 했다. 문화 조건 관심의 세포 유형에 따라 달라 집니다 동안 끝점 organoids의 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 1. 상피 세포의 변화 하는 미디어 매트릭스 젤으로 시드 필요한 자료를 수집: 인간의 기본 전립선 상피 세포 (예약), 얼음, 96-잘 microplate, 얼음, keratinocyte 혈 청 무료 미디어 (KSFM)에 매트릭스 젤 숯 박탈된 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 dihydrotestosterone (DHT). KSFM의 47.5 mL 2.5 mL 숯불 박탈된 FBS와 dihydrotestosterone (DHT)의 결합 하 여 얼음에 10 nM DHT, 다음 예약의 최종 농도 KSFM 기반 organoid 미디어를 준비 합니다. 셀 문화 후드 무 균 기술을 사용 하 여 3D 매트릭스로 플레이트 세포. 부드럽게 믹스 감기 KSFM 기반 organoid 미디어 50% 매트릭스를 얼음 처럼 차가운 매트릭스 젤 젤 혼합 천천히 위아래로 pipetting, 거품을 피하.참고: 매트릭스 젤 4 ° C에서 하룻밤 해 동 고 가능 하면 얼음에 보관 될 해야 합니다. 그것은 실내 온도 (RT)에 신속 하 게 굳은 것 이다. 미리 피 펫 팁 차가운 미디어와 전송 40-50 50% 행렬의 μ 젤 96 잘 접시에 사용 될 각의 하단에 젖은. 코트 기본 레이어를 우물의 바닥.이 거품을 만들 수 있습니다 참고: 피 펫에 두 번째 중지 완전히 분배 하지 않습니다. 기본 레이어를 강화 하기 위해 30-45 분 동안 37 ° C 배양 기에 96 잘 접시를 놓습니다.참고: 고형화 했다 또는 셀 수 있습니다 접시의 바닥에 매트릭스를 통해가 고는 단층으로 성장 될 때까지 기본 레이어에 상피 세포를 플레이트 하지 마십시오. 100-1000 셀/100 μ의 최종 농도 달성 하기 위해 매트릭스 젤와 33% 매트릭스 젤 KSFM 기반 organoid 미디어에 상피 세포를 혼합. 플레이트 잘 당 33% 매트릭스 젤/셀 혼합물의 100 μ를 사용 하 여 기본 레이어 위에 상피 세포.참고: 이전 실험 그 상피 세포 차원에서 너무 밀도가 시드 제한 됩니다 organoid 성장의 크기 시드 너무 띄엄띄엄 귀 착될 수 있다 매우 낮은 수익률13동안 나타났습니다. 그것은 관심, 환자 전용 organoid 형성 효율에 따라 셀 형식에 대 한 시드 조건을 최적화 하는 것이 중요입니다. 응고, 매트릭스 젤 수 있도록 30-45 분 동안 37 ° C 배양 기에서 96 잘 접시를 놓습니다 다음 부드럽게 천천히 우물의 가장자리에 pipetting으로 셀 위에 KSFM 기반 organoid 미디어의 100 μ를 추가 합니다. 2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. 우물의 측에 대하여 pipetting 미디어와 매트릭스 젤 사이 공간 신중 하 게 제거 미디어의 50 μ와 신선한 미디어의 50 μ를 바꿉니다.참고: 장기 문화에 대 한 매트릭스 젤 2-3 주에 한 번씩 변경 해야 합니다. 매트릭스 젤 문화 불안정 나타납니다 현미경 반투명 주름을 표시 하는 경우 매트릭스 젤 세분화 했다 그리고 교체 해야 합니다. 2입니다. 매트릭스 젤에서 Organoids의 수집 참고: organoids의 컬렉션은 매트릭스 젤 변경, 뿌리고 또는 RNA 추출, DNA 추출, 단백질 추출, cytometry의 끝점입니다. 따뜻한 중립 protease와 행 크 스 소금물 (HBSS) 37 ° C 물 욕조에 균형. 조심 스럽게 매트릭스 젤을 방해 하지 않고 우물에서 미디어를 제거. 각 잘 ~ 1 ~ 200 μ 중립 protease의 추가: 2 비율 매트릭스 젤: 중립 protease의 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 기계적으로 아래로 pipetting으로 매트릭스 젤: 중립 효소 혼합물을 분리. 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 Microcentrifuge 튜브 또는 볼륨 따라 원뿔 튜브에 중립 protease 매트릭스 젤 세포 혼합물을 전송 합니다. 펠 렛 셀 3-5 분 300 x g 에서 원심.참고: 없는 셀 펠 릿 나타나면 매트릭스 젤 완전 하 게 해리 하지 수 및 분홍색 상쾌한에서 튜브의 하단에 반투명 위상으로 구상 될 수 있다. 제거는 상쾌한 고 추가 더 중립적인 효소 1:2 비율로 매트릭스 젤 펠 릿, 37 ° C에서 또 다른 20-40 분 동안 품 어 300 x g에서 원심 분리를 반복. Organoid 펠 릿 인수는 상쾌한을 제거 합니다. 뿌리고 (단계 2.7.1 참조), organoid 세포 RNA, DNA, 또는 단백질 추출에 대 한 진행 (단계 2.7.2 참조), cytometry, 그리고 단일 셀 시퀀싱 (단계 2.7.3 참조)에 의해 처리 단일 세포. 장기 문화에 대 한 부드럽게 1.1-1.5 단계에 설명 된 단계에 따라 33% 신선한 매트릭스 젤과 접시에 그대로 organoids resuspend. 해리 organoids 단일 셀으로 replate, 따뜻한 휴대-분리 효소의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 및 10-15 분 동안 37 ° C에서 품 어, HBSS의 5 mL로 한번 세척 하 고 다시 다음 단계 1.1-1.5 신선한 매트릭스 젤에 접시. 재료의 테이블에 에서 나열 된 RNA 추출, DNA 추출, 또는 단백질 추출에 대 한 적절 한 세포의 용 해 버퍼에 organoid 펠 릿을 resuspend 하 고 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다. 따뜻한 휴대-분리 효소의 1 mL에 organoids를 resuspend 하 고 단일 세포로는 organoids 해리를 10-15 분 동안 37 ° C에서 품 어. HBSS의 5 mL로 한 번 씻어 고 흐름 cytometry5 또는 단일 셀 시퀀싱18에 대 한 프로토콜.참고: 매트릭스 젤의 낮은 농도에서 단일 세포로 분열을 중립 효소 수 있습니다 필요 하지, 그리고 셀 분리 효소 단계 2.2 후 우물에 직접 적용할 수 있습니다. 3. 전체 잘 이미지 수집 및 Organoid 형태학의 분석 전체-잘 z-스택 이미지를 동력으로 전송된 빛 거꾸로 현미경을 사용 하 여 X / Y 단계 ( 그림 1A에 나와 있는 워크플로) 검색. 우물의 바닥에 조정 초점 위치, 첫 번째 organoid 발생 기본 계층에서 초승달 모양으로 잘의 중심에 있을 것입니다 때까지 위쪽으로 집중 시작 합니다. 이 위치에서 z-플레인을 설정 합니다. 마지막 organoid 초점, 우물의 주변에 있을 것입니다 때까지 위쪽으로 초점을 계속 합니다. 이 위치에서 최고의 z 평면을 설정 합니다.참고: z-스택의 위아래를 설정한 후이 위치 모든 나머지 우물 내에서 organoids 캡처하고 필요에 따라 위/아래 조정 확인 합니다. Z-범위 각 잘 내 모든 organoid 포함 하는 단일 검색에 사용 될 수 있습니다. 잘, 더 큰 해상도 대 한 더 큰 숫자를 사용 하 여 당 15-35 z-비행기를 캡처하십시오. 전체 잘 이미지를 캡처, 병합 하 고 필요한 경우 사분면 또는 하위 수집.참고:이 좋습니다을 단일 반대로 여러 z-비행기 z-비행기, 그림 1B 는 organoids는 초점 하나의 z-비행기를 캡처할 때에서 볼 수 있듯이. 다운스트림 분석에 대 한 z-스택 이미지를 저장 합니다. 자유형 그리기 기능 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. 3.1.4 단계에서 설정 하나의 z-평면 이미지를 엽니다. 필요한 경우, 단일, 전체 그럼 이미지에 각 개별 z-평면에서 찍은 이미지 타일. 새로운 이미지를 별도 파일로 저장 합니다. 각 z-비행기 인수에 대 한이 프로세스를 반복 합니다. 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 단일 우물에서 모든 z-비행기에 대 한 전체-잘 이미지를 열고을 z-비행기의 스택에서 필드 (EDF) 이미지의 확장된 깊이 만듭니다.참고: 이미지의이 종류는 우물의 단일 초점에서 이미지를 만들려면 각 z-비행기의 최고의 초점 영역을 선택 합니다. 측정 되는 이미지의 눈금 막대를 소프트웨어의 픽셀 규모를 설정 합니다. 이미지 소프트웨어의 자유형 그리기 도구를 사용 하 여 모든 organoid 우물에의 경계를 추적 합니다. 이미지 소프트웨어에서 추적된 organoid 경계에 대 한 측정 메트릭을 가져옵니다.참고: 권장된 매개 변수는 지역, 순환, 및 최대/최소 반경 비율. 이 통계의 응용 프로그램을 설명 하는 대표적인 결과 그림 1C에 표시 됩니다. 지역은 organoid의 경계에 의해 정의 된 다각형에서 계산 됩니다. 진원도 직경 동등한은 organoid의 최대 흰 족제비, 0은 덜 원형 그리고 1 더 원형 원과의 영역에 organoid 영역의 비율입니다. 최대/최소 반경 최대 반지름과 최소 추적된 organoid 반경 사이의 비율이입니다.순환 =반경 비율 = 4. 포 르 말린 고정 및 파라핀 조직학 끝점에 대 한 Organoids의 포함 포함 공급 준비: HBSS, 2 %agar 솔루션, 조직학 마킹 염료, 조직학 젤 플라스틱 팁 형, 테이프, 플런저 1 cc 인슐린 주사기, 얼음 팩, 카세트, 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF), 연필, 그리고 75% 조직학 급료 에탄올 (EtOH)에서. 2 개의 microcentrifuge 관 2 %agar 솔루션의 준비. 물 욕조에 또는 액체 형태로 agar를 유지 하기 위해 100-110 ° C에서 열 블록에 품 어. 1-2 방울 더 연결 하 고 포함 하는 동안 방향 유지에 염료는 agar의 상위를 나타내는 것입니다 2 %agar 솔루션 중 하나를 표시를 추가 합니다. 잘 믹스. 55-65 ° c.에 물 목욕 또는 열 블록에서 조직학 젤 따뜻한 1000 μ 피 펫 팁을 사용 하 여, 피 펫 팁 ~ 50 μ를 보유 하 고 실린더 만들기의 작은 부분을 절단 하 여 금형을 만듭니다. 첫 번째 금형 주위에 맞는 두 번째, 더 넓은 금형을 만듭니다. 포장 테이프 (접착성 측을)으로 얼음 팩 테이프 형 준수 여 감기 블록을 만듭니다. 1 cc 인슐린 주사기에서 플런저를 제거 하 여 플런저를 만듭니다. 그림 2A에묘사 된 워크플로 다음 처리를 위해 조직학 젤 플러그에는 organoids를 포함 합니다. 매트릭스 젤 해리 고 단계 2.1-2.7에 따라 organoids을 펠 렛. 300 x g 에서 3-5 분 동안 회전 하는 상쾌한 제거 하 여 HBSS 고 다시 펠 렛의 1 mL를 한번 organoid 펠 릿을 세척. 다시 액체 조직학 젤의 30-50 μ에 organoid 펠 릿을 일시 중단 합니다. 부드럽게 천천히 위아래로 pipetting으로 혼합. 차가운 블록에 금형으로 조직학 젤/organoid 혼합물을 전송 하 고 냉각 하 고 플러그인으로 공고히 견본을 허용. 플런저를 사용 하 여 작은 금형 및 큰 금형에 플러그를 밀어. 큰 금형을 채우기 위해 플러그 주위 분명 2 %agar 플라스틱 조직학 염료 착 색 2 %agar 샘플의 상위를 플러그 위에 플라스틱 일단 냉각, 조직학 카세트에 플러그를 전송 하는 플런저를 사용 합니다. 10%에 연필과 장소 카세트를 사용 하 여 카세트 라벨 NBF 고정 하룻밤을 위한. 10%에서 카세트를 전송 70% 조직학 학년 EtOH NBF. 프로세스 조직학 젤 사용 가능한 경우는 프로세서에 사전 설정된 생 프로토콜을 사용 하 여 연결 합니다. 사전 설정을 사용할 수 없는 경우 다음 시퀀스 및 길이 입력: 70% EtOH 6 분, 70% EtOH 10 분, 80% EtOH 10 분, 95% EtOH 2 시간 10 분, 100% EtOH 3 시간 10 분, 15 분 동안 3 번 크 실 렌 3 시간 15 분 대 한 파라핀 권장에서 일탈 하 고 시퀀스 처리 파열된 organoids (그림 3A) 발생할 수 있습니다. 이 처음으로 구분 수를 organoids를 포함 하는 변색된 부분 허용 됩니다 색 부분이 위로 향하도록 조직학 젤 플러그를 포함 합니다. 섹션 FFPE 조직학 젤 블록: 필요한 공급 수집: FFPE 조직학 젤 블록, 조직학 펜, 조직 부동 물, 얼음, 톰, 톰 블레이드, 워크스테이션, 긍정적으로 위탁 현미경 슬라이드 및 실험실 오븐 포함 얼음 양동이. 채우기 물 목욕까지 매우 전체 및 40 ° C로 설정 후 미리 따뜻한 실험실 오븐 45-50 ° c 얼음 양동이 준비 다음 얼음와 얼음 물 슬러리를 만드는 물을 추가. 때까지 그들은 매우 추운 얼음 블록을 진정.참고: 블록 얼음에 1 일 최대 설정할 수 있습니다 하지만 만약 하룻밤 왼쪽 블록 화 될 것입니다 다시 처리 될 필요가 있을 것 이다. 톰 카세트 클램프 블록 삽입 나이프 홀더를 블레이드를 추가 하 고 컴퓨터에서 모든 보호조치 잠금 해제. 파라핀 블록 (적) 10 µ m 두께 얼굴을 정돈 하 여 시작 합니다. 일단 섹션 나온다 플러그 영역이 포함 된, 트리밍 중지 하 고 톰 회전자를 고정 한 진정 얼음에 다시 블록을 전송. 여러 블록 구분 될 경우, 각 얼굴 4.5.6 단계로 이동 하기 전에 차단 합니다. 새, 사용 하지 않는 부분에 블레이드를 이동 하 고 다시 클램프 블록을 전송. 컴퓨터의 잠금을 해제 하 고 섹션 당 5 μ m에서 트리밍 시작 합니다.참고: 최상의 결과 얻으려면 5 μ m를 권장 하지만 3-10 μ m 하 셔도 됩니다. 핀셋을 사용 하 여, 40 ° C 물 목욕 하는 섹션을 전송 하 고 밖으로 확산 섹션을 허용 합니다. 물에 세로로 찍기 하 여 슬라이드에 섹션을 전송.참고: 각도에서 찍기 섹션 거품 목욕의 바닥에서 전송 하 고 샘플의 왜곡이 발생할 수 있습니다. (그림 2BC) 현미경 섹션을 시각화.참고: 있는 organoid 존재, 그것 표시 됩니다 그림 2B에서 빨간색 화살표와 비슷합니다. 거품 (그림 2B, 파란색 화살표) organoids와 유사한 나타날 수 있으며 건조 organoids 나타나는 반투명 (그림 2C) 신선한 슬라이드에 분별 하기 쉽습니다. 아무 organoids는 존재 하는, 블록에 섹션 추가. Organoids 포함 된 슬라이드를 획득 하는 경우 슬라이드의 뒷면에서 섹션 주변 조직학 펜와 45-50 ° c.에 하룻밤 구워 원형 슬라이드를 수집 및 H & E 진행 (단계 4.9.1 참조) immunohistochemical (단계 4.9.2 참조), 또는 immunofluorescent 얼룩 (단계 5 참조).참고: 대표적인 결과 그림 3B에 표시 됩니다. H & E 염색을 수행 하려면 재료 목록에서 키트를 얻을 하 고 제조업체의 사양을 따릅니다. Immunohistochemical 얼룩을 수행 하려면 재료 목록에서 키트 및 1 차적인 항 체를 얻을 하 고 제조업체의 사양을 따릅니다. 5. immunofluorescent FFPE의 얼룩이 지 고 Sectioned Organoids 수집 용품: 4 단계에서 구운된 슬라이드, 크 실 렌, 100 %EtOH, 95 %EtOH, 70 %EtOH, 이온된 수 (디 H2O), coplin 항아리, 항 원 검색 인산 염 버퍼 솔루션 (나트륨 구 연산 염 버퍼 또는 EDTA Tris 버퍼), 식 염 수 (PBS), 5% 정상 말 혈 청 (x 1 보 건국) PBS, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS, 랙 얼룩, 얼룩 접시, 챔버, 소수 성 장벽 펜, 습기, 1 °와 관심, 그리고 counterstains의의 항 체 2 ° 들리면에 0.3% 비 이온 세제에 0.1% 비 이온 세제로 관심입니다. Deparaffinize 및 coplins 다음 솔루션으로 가득에 담거 서 슬라이드를 rehydrate: 크 실 렌 (3 딥, 5 분), 100 %EtOH (2 딥, 3 분 각), 95 %EtOH (2 딥, 3 분 각), 70 %EtOH (2 딥, 3 분 각), 그리고 디 H2O 2 (딥 각 3 분). Antigen 검색 솔루션 및 100 ° c 사전 열 은폐 챔버 얼룩 요리를 채우기 미리가 열된 착 색 접시에 슬라이드를 immersing 하 여 항 원 복구를 수행 하 고 100 ° c.에 5-10 분 동안 품 어 주기가 완료 되 면, 뚜껑을 열기 전에 20 분 동안 앉아 은폐 챔버를 하실 수 있습니다. 슬라이드 접시가 RT에 냉각 하 고, 일단 실행 디 h 조2O를 5 분에 대 한 슬라이드를 헹 굴 착 색 접시를 놓습니다. 얼룩 접시에서 슬라이드를 제거 하 고 소수 성 장벽 펜 샘플 원을 그립니다 습도 챔버에 슬라이드를 하다. 어떤 비 특정 항 체를 샘플 주위 소수 서클에 PBS에 0.1% 비 이온 세제로 보 건국 5%를 적용 하 여 얼룩 차단 (약 30 μ 샘플을 충당 하기 위해 필요). Coplins 워시 슬라이드 PBS 3 시간 5 분으로 가득합니다. 추가 1 ° 항 체 (자료 테이블) 샘플 주위 소수 서클에 PBS에 0.3% 비 이온 세제로 1 %BSA 희석 (약 30 μ 섹션 커버 한다), 다음 RT에 또는 하룻밤 습도 챔버에 4 ° C에서 1 시간에 품 어. Coplins PBS 3 시간 5 분으로 가득에 슬라이드를 씻어. 추가 2 ° 항 체 샘플 주위 소수 서클에 PBS에 0.3% 비 이온 세제로 1 %BSA 희석 (약 30 μ 영역을 다룰 것입니다), 다음 1 h 습도 챔버 RT에 대 한 품 어. PBS 3 시간 5 분으로 가득 coplin에 슬라이드를 씻어. 추가 샘플, 주위 소수 서클에 PBS에 0.3% 비 이온 세제로 1 %BSA 제조업체의 사양에 희석 DAPI 다음 어둠 (30 μ)에서 2-5 분 RT에서 품 어. Coplins PBS 3 시간 5 분으로 가득에 슬라이드를 씻어. Antifade 설치 미디어와 coverslip, 슬라이드를 탑재 다음 현미경 결과 시각화. 6. Immunofluorescent 얼룩에 대 한 Organoids의 전체 설치 수집 용품: 챔버 슬라이드 또는 confocal 접시, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 통, 50mm NH4Cl PBS, PBS, PBS, PBS, 1 °와 2 ° 항 체에 0.3% 비 이온 세제로 1 %BSA에서 0.1% 비 이온 세제로 보 건국 5%에서에서 0.1% 비 이온 세제에 관심, 그리고 관심의 counterstains. 조심 스럽게 organoid 문화 미디어와 매트릭스 젤 사이 공간을 떠나 잘의 측에 대하여 pipetting으로 방해 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거. 사용 하 여 트림, 사전 미디어 또는 PBS, 젖은 1000 μ 피 펫 팁, 관심의 organoid(s)를 포함 하는 매트릭스 젤의 한 방울 (25-50 μ)를 인출 하 고 챔버 슬라이드 잘 또는 confocal 접시의 중앙에 분배.참고: 솔리드 33% 매트릭스 젤은 없습니다. 그것은 완전히 설정 하지 젤로 비슷한 처리 젤라틴 액체입니다. 큰 오프닝 트림된 피 펫 팁 전송 도중에서 organoids를 방지할 것 이다. Organoids 부모 문화에 남아, 미디어를 따뜻한 KSFM에 기초를 둔 미디어 바꿉니다. 육안 또는 해 범위 초과 미디어와 매트릭스 젤 파인 팁 피 펫 (10-200 μ)와 챔버 슬라이드에서 발음.참고: 부착 시와 챔버 슬라이드를 pretreat 옵션 이다. 남은 매트릭스의 autofluorescence를 관찰 하는 선택적 제어 챔버 슬라이드의 빈 우물에 매트릭스 젤의 동일한 볼륨을 접시. 유리에 고착 하 고 세척 단계 샘플의 손실을 방지 organoid 홍보를 30-45 분 동안 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 놓습니다. 천천히를 pipetting 슬라이드에서 분리 방지, 부드럽게 흔들어 동안 RT에 5 분에 대 한 1 x PBS의 200 μ와 organoids를 세척. PBS와 부드럽게 흔들어 동안 RT에서 30 분 동안 4 %paraformaldehyde 200 μ와 수정 x 1을 제거 합니다. 매트릭스 젤이이 단계 후에 분명 나타나는지 확인 합니다.참고: 메탄올 또는 포 르 말린 고정 또한 가능 하다. 고정 방법은 특정 종류의 고정 방식이 있습니다 crosslink 관심의 항 원 또는 형광-라벨-관심사의 단백질을 끄다 특정 항 체에 대 한 최적화 되어야 합니다. 정착 액을 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척.참고: 단계 세척의 길이 organoid 크기에 따라 최적화 되어야 합니다. 5 분은 충분 한 시작 지점, 하지만 필요에 따라 세척 단계를 길게 할 수 있다. 부드럽게 흔들어 동안 50mm NH41 x PBS RT에서 30 분 동안에 Cl의 200 μ와 autofluorescence를 끄다.참고:이 단계는 organoid의 루멘에서 파편 및 실험 설계에서 발생할 수 있습니다 (GFP) 등 형광 단백질 식 autofluorescence를 끄다 것입니다. 488 채널에는 fluorophore를 사용을 하지만 GFP 신호를 보존 하기 위해 원하는 경우 건너뛸 수 있습니다 경우에 포함 되어야 합니다. NH4Cl를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척. 부드럽게 흔들어 동안 RT에서 30 분 동안 1 x PBS에 0.1% 비 이온 세제-100의 200 μ에 organoids를 permeabilize. 부드럽게 흔들어 동안 PBS와 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척 1 회에 0.1% 비 이온 세제-100를 제거 합니다. PBS에서 0.1% 비 이온 세제 X-100 200 μ와 5% 보 건국으로 차단 하 고 부드럽게 흔들어 동안 RT에서 60 분 동안 품 어. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척. 0.3%와 1 %BSA 1 ° 항 체 희석 1 x PBS에 Triton X-100 챔버 슬라이드의 200 μ에 추가 하 고 다음 4 ° c.에 1-3 일 동안 품 어 1 ° 항 체를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척. 0.3%와 1 %BSA 2 ° 항 체 희석 1 x PBS에 Triton X-100 챔버 슬라이드의 200 μ에 추가 그리고 어둠 속에서 4 ° C에서 1-3 일 동안 품 어.참고: 보육 시간 길이 organoid 크기와 항 체에 대 한 최적화 되어야 합니다. 일부는 organoid를 관통 하는 시간이 더 필요 합니다. 또한 항 체 농도 최적화가 필요 합니다. 일반적으로, 2 x FFPE 섹션 사용 농도 1 ° 항 체에 대 한 적절 한 고 FFPE 섹션에 대 한 동일한 농도 2 ° 항 체에 대 한 적절 한. 2 ° 항 체를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척. Counterstain phalloidin와 말라와 DAPI 또는 Hoescht, 0.3%와 1 %BSA 제조업체의 권장 사항에 따라 희석 핵 트리톤-X 1 x PBS에. 챔버 슬라이드를 200 μ를 추가 후 어둠 속에서 40 분 RT에서 품 어. 신선한 1 PBS 또는 설치 미디어의 200 μ에 탑재 하 고 즉시 이미지 (형광 보존 되어야 아니라면 더 이상 최대 5 일 동안). 대표 결과 그림 3C에 표시 됩니다.참고: 나트륨 아 지 드 confocal 영상 쉽게 사용할 수 없는 경우 오염을 방지 하기 위해 샘플을 추가할 수 있습니다. 개간 에이전트 추가 이미지를 개선할 수 있습니다. 7. 분석 및 형광 프로브에 대 한 Organoids의 전체 설치 참고: 상업적으로 이용 가능한 분석 실험 및 형광 프로브/염료 (예는 재료 목록에 포함 됩니다) 있습니다 전체 실장 organoids 유용한 끝점19의 다양 한 관찰 하에 사용 하기 위해 amendable. 다음 프로토콜은 듀 확산 붙일 셔 서 키트 인데 어떤 키트 전체 마운트 예제와 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 조심 스럽게 미디어의 50 μ를 제거 하 고 미디어와 매트릭스 젤 사이 공간을 떠나 잘의 측에 대하여 pipetting으로 듀 솔루션 작업 x 20 μ M 2의 50 μ를 바꿉니다. 1-3 일 (듀 통합 시간 원하는 길이로 세포 유형의 선택에 대 한 최적화 합니다) 4 ° C에서 품 어. 단계 6.2-6.8 챔버 슬라이드 또는 confocal 요리에 관심의 organoids를 전송 합니다. PBS를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 3.7% paraformaldehyde RT에서 30 분의 200 μ와 수정. 있도록 매트릭스 젤이이 단계 후에 분명히 표시. 정착 액을 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS의 200 μ로 두 번 세척. PBS를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 0.5% 비 이온 세제-100의 200 μ RT에서 30 분 동안 1 x PBS에 추가. 제조업체의 사양에 따라 칵테일 형광 반응 x 1을 준비 합니다. 0.5% 비 이온 세제-100를 제거 하 고 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS에 3 %BSA 200 μ로 두 번 세척. 반응 칵테일을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어. 부드럽게 흔들어 동안 5 분의 1 x PBS에 형광 반응 칵테일 및 3 %BSA 200 μ로 한번 세척을 제거 합니다. Counterstain 및 따라 마운트 6.21-6.22 (그림 3D) 단계.