処理と人間プライマリ前立腺培養の評価

次のプロトコルは、イリノイ大学シカゴの病院で患者のティッシュから収穫される人間の一次前立腺上皮細胞を使用して最適化されていました。これらの実験に使用されるすべての人間組織は買収による治験審査委員会承認プロトコルやイリノイ大学シカゴ校免除だった一方、培養条件は、目的のセルの種類によって異なりますが、エンドポイントはオルガノイドの他の組織に適用できます。 1. マトリックス ゲルとメディアを変更する上皮細胞の播種 必要な材料を集める: ひと前立腺上皮細胞 (PrE)、氷上、96 ウェル マイクロ プレート、氷上では、血清無料メディア ケラチノ サイト (KSFM) 行列ゲル炭剥かれたウシ胎児血清 (FBS)、ジヒドロテストステロン (DHT) です。 氷の上 10 nM、DHT、予備の最終的な集中に木炭除去 FBS とジヒドロテストステロン (DHT) の 2.5 ml 47.5 KSFM mL を組み合わせることにより KSFM ベースにおけるメディアを準備します。 生殖不能の技術を使用して細胞文化フードの 3 D マトリックス プレート セル。 ゆっくりミックス冷たい冷たいマトリックス ゲル 50% 行列の取得と KSFM ベースにおけるメディア ゲル混合によるゆっくりとピペッティングを上下、泡を回避します。注: マトリックス ゲルが 4 ° C で一晩解凍し、可能な限り氷で保たれます。それは室温 (RT) で迅速に固化します。 前 50% 行列の μ L のゲルの 96 ウェル プレートで使用される各井戸の底に冷たいメディアと転送 40-50 のピペット チップを濡れています。ベース層を形成する井戸の底をコートします。注: 完全に分配しないピペットで目のストップをこれは泡を作成することができます。 ベース層を固めるための 30-45 分の 37 ° C の定温器に 96 ウェル プレートを配置します。注: を行う基本レイヤーの上に上皮細胞をプレートないまでそれが凝固した、またはセルが行列をプレートの底に落ちるし、単層として成長します。 上皮細胞 KSFM ベースにおけるメディア 100-1,000 セル/100 μ L の最終的な集中を達成するためにマトリックス ゲルと 33% 行列ゲル懸をミックスします。プレート 33% 行列の 100 μ L を使用して基本レイヤーの上に上皮細胞ゲル/セルあたりよく混合物。注: 前の実験は、3 D でも密集上皮細胞を播種のサイズを制限における成長が、非常に低い利回り13もまばらとなるシードを示しています。患者固有の器官毛細生成効率に基づく興味のセル型の播種条件を最適化することが重要です。 固化、マトリックス ゲルを許可する 30-45 分の 37 ° C の定温器の 96 ウェル プレートを配置し、そっと井戸の端にゆっくりとピペッティングにより細胞の上に KSFM ベースにおけるメディアの 100 μ L を追加します。 2-3 日ごとにメディアを変更します。井戸の側に対してピペッティング メディアと行列ゲル間のスペース慎重にメディアの 50 μ L を削除し、新鮮なメディアの 50 μ L に置き換えます。注: 長期培養のマトリックス ゲルの 2-3 週間ごとに変更する必要があります。ゲル培養不安定表示され顕微鏡下で半透明のしわ場合、行列ゲル壊れているし、交換する必要があります。 2. 行列のゲルからオルガノイドのコレクション 注: オルガノイドのコレクションは、マトリックス ゲル変更や継 RNA の抽出、DNA 抽出、タンパク質の抽出とフローサイトメトリーのエンドポイントの必要です。 温かみのある中性プロテアーゼ、ハンクスは平衡塩類溶液 (HBSS) 37 ° C の水浴中です。 井戸から行列ゲルを中断させることがなくメディアを慎重に取り外します。 〜 1 に中性プロテアーゼ 〜 200 μ L を各ウェルに追加: 2 比行列ゲル: 中性プロテアーゼの 37 ° C で 20 分間インキュベートし、 機械的に上下にピペッティングによるマトリックス ゲル: 中性プロテアーゼ混合物を切り離します。 37 ° C で 20 分間インキュベートします。 微量遠心チューブや量に応じての円錐管に中性プロテアーゼ マトリックスのゲル-セルの混合物を転送します。細胞ペレットに 3-5 分間、300 × gで遠心分離機します。注: 細胞ペレットは表示されません、マトリックス ゲルが完全に分離できない場合があり、ピンクの上澄みから個別の管の下部に半透明相として視覚化することができます。上澄みを除去し 1:2 の比率でより中立的なプロテアーゼをゲル ペレットのマトリックスに追加、37 ° C で別の 20-40 分間インキュベートし、300 × gで遠心分離を繰り返します。 Organoid ペレットを取得したときは、上澄みを除去します。継 (ステップ 2.7.1 を参照)、タンパク質や DNA、RNA の抽出における換散を続行 (2.7.2 のステップを参照)、処理単一細胞フローサイトメトリー、および単一セルの配列 (ステップ 2.7.3 を参照)。 長期培養の優しく 1.1-1.5 の手順で説明されている手順に従うことによって 33% 新鮮なマトリックス ゲルとプレートにそのままオルガノイドを再懸濁します。オルガノイドを切り離して考えると単一セルとして replate、暖かい細胞解離酵素の 1 mL にペレットを再懸濁します、10-15 分の 37 ° C で孵化させなさい、HBSS、5 mL で 1 回洗浄し、再次の手順 1.1-1.5 新鮮なマトリックス ゲル板します。 材料の表に記載されている RNA の抽出、DNA 抽出、または蛋白質の抽出のための適切な換散バッファー内におけるペレットを再懸濁します、製造元のプロトコルに従います。 暖かい細胞解離酵素の 1 つの mL でオルガノイドを再懸濁します、単一セル、オルガノイドを分離するに 10-15 分の 37 ° C で孵化させなさい。HBSS の 5 mL で 1 回洗浄し、流れ cytometry5または単一セル配列18プロトコルに進みます。注: マトリックス ゲルの低濃度で単一のセルに分離する中性プロテアーゼが不要となるし、細胞解離酵素は、2.2 のステップの後、井戸に直接適用できます。 3. 全体も画像の取得と Organoid 形態の解析 電動を用いた透過光倒立顕微鏡全体ウェル z スタック画像 X ・ Y ステージ (ワークフロー図 1 aに示されている) をスキャンします。 井戸の底に調整焦点位置、最初 organoid が発生ベース層からメニスカスによる井戸の中心になるまで上方を中心に開始します。この位置にある下の z 平面を設定します。 井戸の周囲になるフォーカスが最後 organoid まで上方を中心に継続します。この位置で一番上の z 平面を設定します。注: z スタックの上下を設定した後、これらの位置とすべての残りウエル内でオルガノイドをキャプチャ上/下を必要に応じて調整を確認します。各ウェル内のすべての器官毛細を含む単一のスキャンに使用される z 範囲が可能になります。 まあ、大きい数を使用してより高い解像度のあたり 15-35 z 平面をキャプチャします。よくイメージ全体を取り込んでマージ必要な場合の作業領域やサブセクションを収集します。注:図 1 bのみ 1 つの z 平面をキャプチャするとき organoids が焦点から外れているように単一ではなく複数の z 平面 z 平面を取ることをお勧めします。 下流解析のため z スタック画像を保存します。 フリー フォームの描画機能を備えたイメージ ソフトウェアを使用して画像を分析します。 3.1.4 の手順から設定 1 つの z 平面画像を開きます。 必要な場合、全体も 1 つのイメージにそれぞれの個々 の z 平面で撮影した画像を並べて表示します。新しいイメージを別のファイルとして保存します。各 z 平面の取得のためには、このプロセスを繰り返します。 イメージ ソフトウェアを使用すると、単一の井戸からすべての z 平面全体もイメージを開き、z 平面のスタックからフィールド (EDF) の画像の奥行きを拡張を作成します。注: このタイプのイメージは井戸の単一焦点でイメージを作成する各の z 平面の最高のフォーカス領域を選択します。 ソフトウェアのピクセル スケールを測定されているイメージのスケール バーに設定します。 画像ソフトのフリー フォームの描画ツールを使用して、すべて organoid 井戸の中の境界をトレースします。 画像ソフトからトレースにおける境界の測定指標を取得します。注: 推奨されるパラメーターは、エリア、真円度、最大/最小半径比。これらの指標のアプリケーションを示す代表的な結果は、図 1のとおりです。Organoid の境界によって定義される多角形の面積が計算されます。真円度は、直径イコール、organoid の最大フェレット、0 が少ない循環あり、1 はより円形で円の面積に organoid の領域の比率です。最大/最小半径比は、トレースにおけるの最小半径と最大半径の比率です。真円度 =半径比 = 4. ホルマリン固定・ パラフィン組織学的エンドポイント オルガノイドの埋め込み 埋め込みの供給の準備: HBSS、2% 寒天培地溶液、組織学的マーキング染料、組織学のゲル、ピペット チップ型、テープ、プランジャー 1 cc インスリン注射器と氷のパック、カセット、10% 中性緩衝ホルマリン (NBF)、鉛筆、および 75% の組織学的グレードのエタノール (エタノール)。 2% 寒天液の 2 つの遠心管を準備します。水浴や液状の寒天培地を維持するために 100 ~ 110 ° C で熱ブロックを孵化させなさい。組織の 1-2 滴、寒天培地の上部を示す 2% 寒天のソリューションの 1 つに色素をマーキング プラグし、埋め込み時にオリエンテーションを維持する上で支援追加します。よく混ぜます。 55-65 ° C で水バスまたは熱ブロック組織ゲルをウォーム アップします。 1000 μ L ピペット チップを使用して、~ 50 μ L を保持するシリンダー ピペット チップの小さなセクションを切り出して金型を作成します。最初に金型周りに適合する第二より広い金型を作成します。 テープ (粘着面を上) に氷パックをラップし、テープにカビの付着によりコールド ブロックを作成します。 1 cc インスリン注射器のプランジャーを外してプランジャーを作成します。 図 2Aに示されているワークフローを次の処理のための組織学ゲル プラグに、オルガノイドを埋め込みます。 マトリックス ゲルを切り離して、に従って手順 2.1-2.7 オルガノイドのペレットします。 300 x gで 3-5 分間回転し、上清を取除くことによって HBSS と再ペレットの 1 mL で一度 organoid ペレットを洗浄します。 再液体組織ゲルの 30-50 μ l organoid ペレットを中断します。上下にゆっくりとピペッティングで優しく混ぜます。コールド ブロックの鋳型に組織ゲル/organoid 液を移し、冷却し、プラグに固める標本を許可します。 小さなカビと大きな金型にプラグをプッシュするのにには、プランジャーを使用します。大きな金型に合わせてプラグの周りのピペット クリアの 2% 寒天培。 サンプルの上部を示すためにプラグの上に組織の色素着色 2% 寒天をピペットします。 いったん冷却、組織カセットにプラグインを転送するのにプランジャーを使用します。10% に鉛筆と場所のカセットを使用してカセットのラベル NBF 一晩固定用。 10% からカセットを転送、NBF 異型 70 %etoh を。 プロセス組織ゲルは、利用可能な場合、プロセッサであらかじめ設定生検プロトコルを使用してを差し込みます。プリセットを使用できない場合は、次の順序と長さを入力: 70 %6 分、70% エタノール エタノール 10 分、80% エタノール 10 分、95% エタノール 2 時間 10 分、10 分、15 分の 3 回キシレン 100% EtOH 3 回、3 回 15 分のパラフィンを推奨される逸脱と破裂 organoids (図 3 a) は、シーケンスを処理できます。 これが最初に断面にオルガノイドを含む変色部分を許容する組織ゲル プラグを上向き、色付きの部分に埋め込みます。 FFPE 組織ゲルのブロックのセクション: 必要な物資を収集: FFPE 組織ゲルのブロック、組織学ペン、組織フロート水浴、氷、ミクロトーム、ワークステーション、顕微鏡スライド、および実験室のオーブンを正荷電の埋め込みのミクロトーム刃と氷のバケツ。 塗りつぶし温泉まで非常に完全、40 ° C に設定、前暖かい所オーブンで 45-50 ° c 氷のバケツを準備し、氷でいっぱい、氷-水スラリーを作成するために水を追加します。氷のブロックを冷やすまでは非常に寒い。注: 1 日の氷のブロックを設定できますが、一晩放置、ブロック、水和し再処理する必要があります。 ミクロトーム ユニバーサルカセットク ランプにブロックを挿入ナイフ ホルダーにブレードを追加して、任意ロック対策マシン上のロックを解除します。 10 μ m の厚みで (対決) パラフィン ブロックの顔をトリミングすることによって開始します。セクションはプラグ部を含む出現、一度トリミングを停止、ミクロトーム、ローターをロックし、寒さに氷の上に戻ってブロックを転送します。いくつかのブロックを切断する場合は、それぞれの対決は 4.5.6 のステップに移動する前にブロックします。 新しい未使用の部分をブレードに移動し、ブロックをクランプに転送します。マシンのロックを解除し、セクションごとの 5 μ m でトリミングを開始します。注: 最良の結果を得るには、5 μ m をお勧めしますが、3-10 μ m も可能です。 ピンセットを使用して、40 ° C の水浴にセクションを転送し、セクションを広げるようにします。スライドにセクションを転送するには、垂直に水の中に浸漬します。注: 角度で浸漬し、セクションにお風呂の底から気泡を転送できます、サンプルの歪みが発生します。 顕微鏡 (図 2 b, C) の下でセクションを視覚化します。注: 場合、organoid 存在が図 2B の赤い矢印のように表示されます。泡 (図 2 b, 青い矢印) オルガノイドのように表示することができ、乾燥 organoids 半透明 (図 2) が表示されます、新鮮なスライドで識別し易い。Organoids しない場合を提示、さらにブロックにセクション。 組織学ペンと 45-50 ° C で一晩焼くオルガノイドを含むスライドが取得されたとき円のスライドの背面にセクション周辺 スライドを収集し、H & E に進みます (4.9.1 のステップを参照)、免疫組織化学的 (4.9.2 のステップを参照)、または免疫蛍光染色 (手順 5. を参照)。注:図 3Bの代表的な結果が表示されます。 H & E 染色を実行するには、材料のリストからキットを入手して製造元の仕様に従ってください。 免疫組織化学染色を材料リストからキットと一次抗体を取得して製造元の仕様に従ってください。 5. FFPE の蛍光抗体染色と断面 Organoids 収集用品: ステップ 4 から焼かれたスライド、キシレン、100% エタノール、95% エタノール、70% エタノール、脱イオン水 (ディ H2O) coplin jar、抗原検索ソリューション (ナトリウム クエン酸バッファーまたは EDTA Tris バッファー)、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、5% 通常の馬血清 (x 1NHS) PBS、PBS、ラックを染色、染色皿、商工会議所、疎水性障壁ペン、湿度チャンバー、1 ° 2 ° 抗体興味の counterstains のクロークの解除に非イオン性洗剤で 0.3% 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 0.1% 非イオン性洗剤で関心します。 Deparaffinize し、coplins 以下のソリューションでいっぱいに浸漬によってスライドを水分補給: キシレン (3 ディップ、5 分)、100% エタノール (2 ディップ、3 分ごと)、95% エタノール (2 ディップ、3 分)、70 %etoh (2 ディップ、3 分ごと)、・ ディ ・ H2O (2 ディップ、各 3 分)。 抗原検索ソリューションと 100 ° C に予熱のクロークの解除商工会議所で染色の皿を満たし 事前に加熱された染色皿にスライドを浸すことによって抗原検索を実行し、100 ° C で 5-10 分の間孵化させなさいサイクルが完了すると、蓋を開ける前に 20 分間座って decloaking 商工会議所を許可します。 スライドの皿は、RT に冷却して、一度は、流水・ ディ ・ H2O 5 分用のスライドを洗浄する染色皿を置きます。 染色のお皿からスライドを削除、疎水性障壁ペンでサンプルの周りに円を描くし、湿度チャンバーのスライドを置きます。 染色疎水性サンプル一円に PBS で非イオン性洗剤で 0.1% 5 %nhs を適用することによって、非特異抗体をブロック (約 30 μ L のサンプルをカバーするため必要です)。 Coplins の洗浄のスライドは、PBS 3 回各 5 分でいっぱい。 疎水性サンプル一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa で希釈 1 ° 抗体 (資材表) を追加 (約 30 μ L はセクションをカバーする必要があります)、1 時間常温または一晩で 4 ° C 湿度チャンバー、孵化させなさい。 Coplins PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。 疎水性サンプル一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa で希釈 2 ° 抗体を追加 (約 30 μ L の領域をカバーする)、湿度チャンバーで RT で 1 時間インキュベートし。 Coplin PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。 DAPI、疎水性サンプル、一円に PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 1 %bsa の製造元の仕様に希釈を追加し、暗い (30 μ L) で RT で 2-5 分の間孵化させなさい。 Coplins PBS 3 回各 5 分でいっぱいにスライドを洗います。 Antifade マウント メディアと観察のスライドをマウントし、顕微鏡下で結果を可視化します。 6. 全体取り付けオルガノイドの免疫蛍光染色 収集用品: チェンバー スライドまたは共焦点皿、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、定着性、50 mM NH4PBS PBS pbs は、PBS、1 °、2 ° 抗体の非イオン性洗剤で 0.3% 1 %bsa 非イオン性洗剤で 0.1% 5 %nhs で 0.1% 非イオン性洗剤で Cl興味と関心の counterstains。 まあ、メディアと行列のゲルの間スペースを残しての側に対してピペッティングによる培養、中断することがなく可能な限りとして多くのメディアを慎重に取り外します。 使用済みメディアまたは PBS、ウェット トリミング、1,000 μ L ピペット チップは関心の organoid(s) を含むマトリックス ゲルの一滴 (25-50 μ L) を描画し、チャンバー スライドもや共焦点皿の真ん中に分配します。注: 33% 行列ゲルは固体ではありません。それはゼラチン状流体であり、処理が完全に設定いないゼリーのようです。大きな開口部とトリミングされたピペット チップ転送中に速報 organoids できなくなります。 オルガノイドの親カルチャのまま、暖かい KSFM ベースのメディアとメディアを交換してください。 肉眼や切り裂くスコープ、- ファインチップ ピペット (10-200 μ L) とチェンバー スライドから過剰なメディアと行列のゲルを吸引します。注: それは付着性試薬によるチェンバー スライドを前処理するオプションです。 残りの行列の蛍光を観察するオプションのコントロールとしてチェンバー スライドの空井戸に行列ゲルの等量をプレートします。 ガラスに付着し、洗浄手順の中にサンプルの損失を防ぐ organoid を促進するために 30-45 分の 37 ° C の定温器にチェンバー スライドを配置します。 軽く振りながら常温を 5 分の 1 × PBS の 200 μ l/オルガノイドを洗う、スライドからの剥離を防ぐためにゆっくりとピペッティング。 1 × PBS と優しく揺れながら常温 30 分 4% パラホルムアルデヒドの 200 μ L と修正を削除します。マトリックス ゲルがこのステップの後明確な表示されることを確認します。注: メタノール、ホルマリンの固定も可能です。固定する方法は、特定の固定方法、クロスリンク可能性があります興味の抗原または興味の蛍光標識蛋白質を消す特異抗体の最適化必要があります。 固定を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。注: 洗浄手順の長さは organoid サイズに応じて最適化する必要があります。5 分は十分な開始ポイントが、必要に応じて、洗浄工程を長くことができます。 軽く振りながら 50 mM NH4RT で 30 分の 1 × PBS で Cl の 200 μ L と蛍光を癒します。注: この手順は、organoid の内腔の残骸から、実験的なデザインから生じる (GFP) などの蛍光蛋白質の表現からの自家蛍光を癒やします。それは 488 のチャネルで、蛍光体を使用する必要が、GFP の信号を維持するために必要な場合にスキップすることができる場合は、含まれているはずです。 NH4Cl を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。 軽く振りながら 0.1% 非イオン性洗剤 100 RT で 30 分の 1 × PBS での 200 μ l オルガノイドを permeabilize します。 軽く振りながら 1 × PBS と 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗浄で 0.1% 非イオン性洗剤 100 を削除します。 200 μ L の PBS で 0.1% 非イオン性洗剤 X-100 と 5 %nhs とブロックし、優しく揺れながら室温で 60 分間インキュベートします。 ブロック バッファーを削除し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗ってください。 0.3% と 1 %bsa で 1 ° 抗体を希釈 1 × PBS でトリトン X-100 チェンバー スライドの 200 μ L を追加し、4 ° C で 1-3 日間インキュベート 1 ° 抗体を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。 0.3% と 1 %bsa の 2 ° 抗体を希釈 1 × PBS でトリトン X-100 チェンバー スライドの 200 μ L を追加し、暗闇の中で 4 ° C で 1-3 日間インキュベートします。注: インキュベーション時間の長さは、organoid サイズと抗体を最適化する必要があります。いくつかは、organoid 貫通するより多くの時間を必要があります。抗体濃度を最適化する必要があります。一般に、2 x FFPE のセクションの使用濃度は 1 ° 抗体に適した、FFPE セクションの同じ濃度に適した 2 ° 抗体。 2 ° 抗体を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。 ファロイジンをアクチンと DAPI や Hoescht、0.3% と 1 %bsa の製造元の推奨事項に従って希釈と核の対比染色 1 × PBS でトリトン X。チェンバー スライドに 200 μ L を追加し、RT で暗闇の中で 40 分間インキュベートします。 新鮮な 1 × PBS またはメディアをマウントの 200 μ l マウントし、すぐにイメージ (より長くないなら最大 5 日間の蛍光が保存する必要があります)。代表的な結果を図 3に示します。注: アジ化ナトリウムは、共焦点レーザー顕微鏡が容易に利用可能でない場合、汚染を防ぐためにサンプルを追加できます。クリア エージェントを追加すると、画像が向上します。 7 試金および蛍光プローブのオルガノイドの全体取付 注: があります市販の試金および蛍光プローブ/染料 (例は材料のリストに含まれています) 全体載 organoids 様々 な有用なエンドポイント19を観察するために使用するため除去。次のプロトコルはエドゥ増殖の蛍光標識キットの全体マウントのサンプルで使用するためのキットを変更ことができます。 慎重にメディアの 50 μ L を削除し、メディアと行列ゲル間のスペースを残して、井戸の側に対してピペッティングによる作業教育ソリューション x 20 μ M 2 の 50 μ L で置き換えます。 1-3 日 (エドゥの混入のための時間の希望の長さを選択したセル型用に最適化する必要があります)、4 ° C で孵化させなさい。 6.2-6.8 チェンバー スライドや共焦点料理に関心のオルガノイドを転送するための手順に従います。 PBS を取り外し、常温 30 分 3.7% パラホルムアルデヒドの 200 μ L を軽く振りながら。マトリックスは、このステップの後はゲルは明瞭であります。 固定を外し、軽く振りながら 200 μ L の 5 分の 1 × PBS で 2 回洗います。PBS を削除し、軽く振りながら RT で 30 分の 1 × PBS で 0.5% 非イオン性洗剤 100 の 200 μ L を追加します。 蛍光反応の製造元の仕様に従ってカクテル × 1 を準備します。 0.5% 非イオン性洗剤 100 を外し、軽く振りながら 5 分 1 × PBS で 3 %bsa の 200 μ L で 2 回洗います。 反応のカクテルを追加し、暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。 5 分の 1 × PBS で優しく揺れながらカクテルと 3 %bsa の 200 μ L で一度洗って蛍光反応を削除します。対比染色とに従ってマウント手順 6.21-6.22 (図 3 D)。