Bearbeitung und Bewertung der menschlichen primäre Prostata organoide Kultur

Das folgende Protokoll wurde durch menschliche primäre epithelialen Zellen der Prostata geerntet von Patienten Gewebe an der University of Illinois in Chicago Krankenhaus optimiert. Allen menschliche Geweben verwendet für diese Experimente wurden erworbenen über eine Institutional Review Board genehmigt Protokoll und/oder Befreiung an der University of Illinois at Chicago. Die Kulturbedingungen variiert abhängig von der Zelle Art von Interesse, können die Endpunkte auf Organellen von anderen Geweben angewendet werden. (1) Aussaat von Epithelzellen in Matrix-Gel und wechselnden Medien Notwendige Materialien sammeln: menschliche primäre Prostate Epithelzellen (PrE), Matrix-Gel auf dem Eis, 96-Well Mikrotestplatte Keratinozyten serumfreie Medien (KSFM) auf dem Eis, Kohle, abgespeckte fetalen bovine Serum (FBS) und Dihydrotestosteron (DHT). Bereiten Sie KSFM-basierte organoide Medien durch die Kombination von 47,5 mL KSFM mit 2,5 mL Holzkohle abgespeckte FBS und Dihydrotestosteron (DHT), eine Endkonzentration von 10 nM DHT, dann Reserve auf Eis. Platte Zellen in eine 3D Matrix in eine Zelle-Kultur-Haube mit steriler Technik. Sanft Mischung kalte KSFM basierende organoide Medien mit eiskalten Matrix Gel zu einer 50 %-Matrix gel-Mischung von langsam rauf und runter pipettieren, Luftblasen zu vermeiden.Hinweis: Matrix Gel sollte über Nacht bei 4 ° C aufgetaut und auf Eis, wann immer möglich gehalten werden. Es erstarrt schnell bei Raumtemperatur (RT). Vornässen einer Pipettenspitze in kalte Medien und Transfer 40 – 50 μL der 50 % Matrix gel auf der Unterseite von jedem Bohrloch auf einer 96-Well-Platte verwendet werden. Streichen Sie die Unterseite des Brunnens eine Basisschicht zu bilden.Hinweis: Verzichten Sie nicht vollständig bis zum zweiten Anschlag auf Pipette, da Luftblasen erzeugt werden können. Legen Sie die 96-Well-Platte in 37 ° C Inkubator für 30 – 45 min um die Basisschicht zu festigen.Hinweis: Epithelzellen auf die Tragschicht nicht Teller, bis es verfestigt hat, oder Zellen fallen durch die Matrix auf der Unterseite der Platte und als eine Monolage wachsen können. Mischen Sie Epithelzellen in KSFM-basierte organoide Matrix Gel, eine Endkonzentration von 100 – 1.000 Zellen/100 μL zu erreichen und 33 % Matrix Gel Medien ausgesetzt. Platte Epithelzellen auf Tragschichten mit 100 μl 33 % Matrix Gel/Zelle Mischung pro Bohrloch.Hinweis: Frühere Experimente haben gezeigt, dass die Aussaat Epithelzellen zu dicht in 3D beschränken die Größe des organoide Wachstum, während Aussaat zu dünn sehr geringe Ausbeute13kann dazu führen. Es ist wichtig, seeding Bedingungen für den Typ von Interesse, die Patienten-spezifischen organoide Bildung Effizienz zu optimieren. Legen Sie die 96-Well-Platte in einem Inkubator 37 ° C für 30-45 min erlauben das Matrix-Gel zu festigen, dann sanft 100 μL KSFM basierende organoide Medien auf Zellen durch Pipettieren langsam gegen den Rand des Brunnens. Wechseln Sie das Medium alle 2 – 3 Tage. Gegen die Seite des Brunnens Pipettieren mit Abstand das Medien und Matrix-Gel sorgfältig entfernen Sie 50 μL der Medien und mit 50 μL der frische Medien ersetzen.Hinweis: Für eine langfristige Kultur, das Matrix-Gel alle 2 – 3 Wochen gewechselt werden muss. Wenn die Matrix Gel Kultur instabil scheint und durchscheinende Falten unter dem Mikroskop zeigt, das Matrix-Gel ist kaputt und muss ersetzt werden. 2. Sammlung von Organellen von Matrix-Gel Hinweis: Sammlung von Organellen ist notwendig für Matrix Gel Änderungen, Passagierung oder Endpunkte der RNA-Extraktion, DNA-Extraktion und Proteingewinnung Durchflusszytometrie. Warmen neutrale Protease und Hanks ausgewogen Salzlösung (HBSS) im Wasserbad 37 ° C. Entfernen Sie vorsichtig Medien aus Brunnen, ohne Störung der Matrix-Gel. Jedes gut ~ 1 ~ 200 μL der neutrale Protease hinzufügen: 2 Verhältnis von Matrix Gel: neutrale Protease und 20 min bei 37 ° c inkubieren Mechanisch distanzieren Sie die Matrix Gel: neutrale Protease Mischung von Pipettieren rauf und runter. 20 min bei 37 ° c inkubieren Übertragen Sie die neutrale Protease-Matrix-Gel-Zell-Mischung zu einem Microcentrifuge Schlauch oder konische Rohr, je nach Volumen. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 3 – 5 min zum pellet-Zellen.Hinweis: Wenn keine Zelle Pellet angezeigt wird, das Matrix-Gel kann nicht vollständig getrennt und als transluzente Phase am unteren Ende der Röhre unterscheidet sich von der rosa überstand visualisiert werden. Entfernen Sie des Überstands fügen Sie mehr neutrale Protease im Verhältnis 1:2 Matrix das Gel Pellet hinzu, weitere 20 – 40 Minuten bei 37 ° C inkubieren Sie und wiederholen Sie Zentrifugation bei 300 X g. Wenn eine organoide Pellet erworben wird, entfernen Sie den überstand. Fahren Sie mit organoide Lyse für RNA oder DNA-Protein-Extraktion Passagierung (siehe Schritt 2.7.1), (siehe Schritt 2.7.2), Verarbeitung einzelne Zellen durch Durchflusszytometrie und einzellige Sequenzierung (siehe Schritt 2.7.3). Aufschwemmen Sie für langfristige Kultur sanft intakte Organellen in 33 % frische Matrix Gel und Teller durch die beschriebenen Schritte in Schritten 1,1 bis 1,5. Um Organellen zu distanzieren und replate als Einzelzellen, das Pellet in 1 mL warme Zelle-Dissoziation Enzyme Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 min, einmal mit 5 mL HBSS waschen und neu Platte in das frische Matrix-Gel nach Schritte 1.1-1.5. Aufschwemmen Sie organoide Pellet in einem geeigneten Lyse-Puffer für RNA-Extraktion, DNA-Extraktion oder Proteingewinnung wie entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien und folgen Sie des Herstellers Protokoll. Organellen in 1 mL warme Zelle-Dissoziation Enzyme Aufschwemmen und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 min zu die Organellen in Einzelzellen zu distanzieren. Einmal mit 5 mL HBSS waschen Sie und fahren Sie mit dem Protokoll für Flow Cytometry5 oder einzellige Sequenzierung18.Hinweis: Um in die einzelnen Zellen bei niedrigen Konzentrationen von Matrix-Gel zu distanzieren, die neutrale Protease nicht erforderlich sein, und Zelle-Dissoziation Enzyme können direkt an den Brunnen nach Schritt 2.2 angewendet werden. (3) ganz gut Bilderfassung und Analyse von organoide Morphologie Ganz gut Z-Stapel Bilder mit invertierten Durchlichtmikroskop mit einem motorisierten X / Y Scan-Bühne (Workflow, dargestellt in Abbildung 1A). Beginnen Sie mit der Fokuslage an der Unterseite des Brunnens angepasst mit Schwerpunkt nach oben, bis die ersten organoide gefunden wird, die in der Mitte des Brunnens aufgrund der Meniskus aus dem base-Layer werden. Legen Sie die untere Z-Ebene an dieser Stelle. Weiter nach oben bis die letzten organoide im Fokus, ist die in der Peripherie des Brunnens werden. Setzen Sie die obere Z-Ebene an dieser Stelle.Hinweis: Nach der Einstellung der oberen und unteren Rand der Z-Stack, stellen Sie sicher, dass diese Positionen die Organellen innerhalb aller übrigen Brunnen erfassen und oben/unten nach Bedarf anpassen. Dies ermöglicht den Z-Bereich für einen einzelnen Scan verwendet werden, die jeden organoide innerhalb jedes gut schließt. 15 – 35 Z-Flugzeuge pro Bohrloch mit einer größeren Anzahl für höhere Auflösung zu erfassen. Erfassen Sie das gesamte gut Bild zu, Zusammenführen Sie und sammeln Sie Quadranten oder Unterabschnitte zu, wenn nötig.Hinweis: Es wird empfohlen, zu mehreren Z-Ebenen im Gegensatz zu einem einzigen Z-Ebene, wie in Abbildung 1 b in der Organellen unscharf sind, wenn nur eine Z-Ebene zu erfassen. Z-Stapel Bilder für nachgelagerte Analyse gespeichert werden. Analysieren von Bildern mit Bild-Software mit Freiform Zeichenfunktionen. Öffnen Sie ein Einzelbild Z-Ebene vom Schritt 3.1.4. Ggf. sollte die Aufnahmen mit jeder einzelnen Z-Ebene in ein einzelnes, ganz gut Bild Fliese. Speichern Sie das neue Bild als separate Datei. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Z-Ebene erworben. Image-Software verwenden, öffnen Sie das ganze gut Bild für jeden Z-Plane aus einem einzigen Brunnen und erstellen Sie eine erweiterte Schärfentiefe Feldbild (EEF) aus dem Stapel des Z-Planes.Hinweis: Diese Art von Bild wählt die besten Fokusregion jeder Z-Ebene um ein Einzelbild im Fokus des Brunnens zu erstellen. Setzen Sie die Pixel Skalierung der Software auf der Maßstab des Bildes, der gemessen wird. Mit dem Freiform-Zeichnung Werkzeug der Bild-Software verfolgen Sie den Rand jeder organoide im Brunnen. Erhalten Sie die Messung Metriken für vektorisierte organoide Umfänge von Image-Software.Hinweis: Empfohlene Parameter sind Bereich, Rundheit und maximale/minimale Radius Verhältnis. Repräsentative Ergebnisse illustrieren die Anwendung dieser Kennzahlen sind in Abbildung 1dargestellt. Bereich errechnet sich aus dem Polygon durch die organoide Perimeter definiert. Zirkularität ist das Verhältnis des Bereichs organoide auf der Fläche eines Kreises mit einem Durchmesser gleich der organoide maximale Frettchen, wobei 0 weniger Runden und 1 ist mehr kreisförmig. Maximale/minimale Radius Ratio ist das Verhältnis zwischen der maximalen Radius und Mindestradius der nachgezeichneten organoide.Zirkularität =Radius-Verhältnis = 4. Formalin Fixierung und Paraffin Einbettung der Organellen für histologische Endpunkte Bereiten Sie einbetten Lieferungen: HBSS, 2 % Agar Lösung, histologische Kennzeichnung Farbstoff, Histologie Gel, pipette, Spitze Form, Klebeband, Kolben aus einer 1 cc Insulin Spritze, Eisbeutel, Kassetten, 10 % neutral gepuffertem Formalin (NBF), Bleistift und 75 % histologische Grad Ethanol (EtOH). Bereiten Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen 2 % Agar Lösung. Inkubieren Sie im Wasserbad oder auf einem Heizblock bei 100 – 110 ° C, Agar in flüssiger Form zu erhalten. Fügen Sie 1 – 2 Tropfen der histologischen Kennzeichnung Farbstoff auf eines der 2 % Agar-Lösungen, die oben auf dem Agar bezeichnen werden anschließen und helfen dabei, die Orientierung während der Einbettung hinzu. Mischen Sie gut. Die Histologie-Gel in einem Wasser-Bad oder Hitze-Block bei 55 – 65 ° c warm Erstellen Sie mithilfe einer Pipettenspitze 1000 μL Formen durch einen kleinen Ausschnitt aus der Pipettenspitze um einen Zylinder zu machen, der ~ 50 μL hält herausschneiden. Erstellen Sie eine zweite, größere Form, die rund um das erste Werkzeug passt. Erstellen Sie einen kalten Block durch umwickeln einen Eisbeutel mit Klebeband (klebende Seite nach oben) und die Einhaltung von Formen auf das Band. Erstellen Sie einen Kolben, indem Sie den Kolben aus einer 1 cc Insulin Spritze. Einbetten der Organellen in einer Histologie Gel Stecker für Verarbeitung, nach den Workflow, dargestellt in Abbildung 2A. Das Matrix-Gel distanzieren und pellet Organellen, indem Sie die folgenden Schritte 2.1-2.7. Waschen Sie organoide Pellet einmal mit 1 mL HBSS und neu pellet von spinning für 3 – 5 min bei 300 X g und den Überstand zu entfernen. Wieder aussetzen Sie organoide Pellet in 30 – 50 μL der flüssigen Histologie Gel. Mischen Sie vorsichtig, durch Pipettieren langsam rauf und runter. Übertragen Sie die Histologie Gel/organoide Mischung in eine Form auf dem kalten Block und lassen Sie die Probe abkühlen und erstarren in einen Stecker. Verwenden Sie einen Kolben, schieben Sie den Stecker aus der kleinen Form und in der größeren Form. Pipette klar 2 % Agar um den Stecker, die größere Form füllen. Pipette histologische Färbung getönt 2 % Agar auf den Stecker an der Spitze der Probe zu kennzeichnen. Sobald Sie abgekühlt, verwenden Sie einen Kolben, um den Stecker in eine Histologie-Kassette zu übertragen. Beschriften Sie die Kassette mit Bleistift und Ort Kassette in 10 % NBF zur Fixierung über Nacht. Übertragen Sie die Kassette von 10 % NBF, histologische Grad 70 % EtOH. Prozess der Histologie-Gel mit einem voreingestellten Biopsie-Protokoll auf einem Prozessor stecken, falls vorhanden. Wenn Preset nicht verfügbar ist, geben Sie die folgende Sequenz und Längen: 70 % EtOH für 6 min, 70 % EtOH für 10 min, 80 % EtOH für 10 min, 95 % EtOH 2 mal 10 min, 100 % EtOH 3 Mal für 10 min, Xylol 3 Mal für 15 min , und Paraffin 3 Mal für 15 min. von der empfohlenen abweichende Bearbeitung Folge geplatzten Organellen (Abbildung 3A) führen kann. Einbetten des Histologie Gel Steckers mit den farbigen Teil nach oben, da dies ermöglicht es den verfärbten Teil enthält die Organellen, in erste geschnitten werden. Abschnitt der Proteinkinase Histologie gel Blöcke: Notwendigen Vorräte zu sammeln: Proteinkinase Histologie gel-Blöcke, Histologie Stift, Gewebe Wasser Floatbad, Eiskübel mit Eis, Mikrotom, Mikrotom klingen, Workstation, positiv geladenen Objektträger und Labor-Ofen einbetten. Füllung-Wasserbad bis sehr voll und Satz auf 40 ° C, dann bereits warm Labor Ofen 45 – 50 ° C. Bereiten Sie einen Eiskübel, dann mit Eis füllen Sie und fügen Sie Wasser hinzu, um ein Eis-Wasser-Suspension zu erstellen. Kühlen Sie die Blöcke auf dem Eis, bis sie sehr kalt sind.Hinweis: Blöcke auf Eis für bis zu 1 Tag eingestellt werden, aber wenn über Nacht verlassen, die Blöcke werden hydratisiert werden und erneut verarbeitet werden müssen. Legen Sie einen Block in Mikrotom Kassette Klemme, Messerhalter die Klinge hinzu, und entsperren Sie Verriegelungen Schutzmaßnahmen auf dem Computer zu. Zunächst schneiden das Gesicht der Paraffinblock (vor sich) bei einer Dicke von 10 µm. Sobald ein Abschnitt mit dem Stecker Bereich entsteht, stoppen Sie trimmen zu, sperren Sie die Mikrotom-Rotor und übertragen Sie den Block zurück aufs Eis zu kühlen. Wenn mehrere Blöcke geschnitten werden sollen, face-off jeden blockieren wechselte 4.5.6 treten. Bewegen Sie die Klinge auf einen neuen, unbenutzten Teil und übertragen Sie den Block zurück zur Klemme. Das Gerät zu entsperren und Trimmen bei 5 μm pro Abschnitt zu beginnen.Hinweis: 5 μm empfiehlt sich für optimale Ergebnisse zu erzielen, aber 3 – 10 μm ist auch akzeptabel. Mit einer Pinzette, Abschnitt um die 40 ° C-Wasserbad und Abschnitt um sich auszubreiten. Übertragen Sie den Abschnitt auf einer Folie durch senkrecht ins Wasser eintauchen.Hinweis: Eintauchen in einem Winkel können Luftblasen aus dem Boden des Bades auf Abschnitt übertragen und verursachen Verzerrung der Stichprobe. Visualisieren Sie den Abschnitt unter Mikroskop (Abb. 2 bC).Hinweis: Wenn eine organoide vorhanden, wird es ähnlich wie bei den roten Pfeil in Abbildung 2 b angezeigt. Bläschen (Abb. 2 b, blauer Pfeil) können ähnlich wie Organellen erscheinen und sind relativ leicht zu erkennen auf einer frisch-Folie wie trockene Organellen transluzente (Abbildung 2) erscheinen. Wenn keine Organellen sind vorhanden, Abschnitt weiter in den Block. Bei Folien mit Organellen erworben haben, Kreisen Sie die Gegend rund um den Bereich auf der Rückseite der Folie mit Histologie Stift und Backen über Nacht bei 45 – 50 ° C. Folien zu sammeln und fahren Sie mit H & E (siehe Schritt 4.9.1), immunhistochemische (siehe Punkt 4.9.2), oder immunofluorescent Färbung (siehe Schritt 5).Hinweis: Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3 bangezeigt. H & E Färbung ausführen, erhalten Sie ein Set aus der Liste der Materialien und folgen Sie den Angaben des Herstellers. Zur Durchführung der immunhistochemischen Färbung erhalten ein Kit und primären Antikörper aus der Materialliste und folgen Sie den Angaben des Herstellers. 5. immunofluorescent Färbung der Proteinkinase und geschnittenen Organellen Vorräte sammeln: gebackene Rutsche aus Schritt 4, Xylol, 100 % EtOH, 95 % EtOH, 70 % EtOH, deionisiertes Wasser (DI H2O), Coplin Gläser, 1 x Antigen Retrieval Lösung (Natrium-Citrat-Puffer oder EDTA-Tris-Puffer), Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), normales Pferd Serum () 5 % NHS) mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer, 1 % Rinderserumalbumin (BSA) mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel in PBS, Färbung Rack, Färbung der Schale, enttarnen, Kammer, hydrophobe Barriere Stift, feuchte Kammer, 1° und 2° Antikörper der Zins- und Counterstains des Interesse. Deparaffinize und rehydrieren die Folien durch Eintauchen in Coplins gefüllt mit den folgenden Lösungen: Xylol (3 Dips, 5 min), 100 % EtOH (2 Dips, 3 min), 95 % EtOH (je 2 Dips, 3 min), 70 % EtOH (je 2 Dips, 3 min) und DI H2O (2 Dips 3 min). Füllen Sie die Färbung Schale mit Antigen-Retrieval-Lösung und Pre enttarnen Wärmekammer bis 100 ° C. Führen Sie Antigen-Retrieval durch Eintauchen der Folien in die vorgewärmte Schüssel Färbung und 5 – 10 min bei 100 ° c inkubieren Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, können Sie die enttarnen Kammer für 20 min sitzen vor dem Öffnen des Deckels. Sobald die Folie Schale auf RT abgekühlt ist, legen Sie die Färbung Schale unter fließendem DI H2O, die Folien für 5 min spülen. Entfernen Sie die Folien aus der Färbung Schale, zeichnen Sie einen Kreis um die Probe mit einem hydrophobe Barriere-Stift und legen Sie die Folie auf die feuchte Kammer. Eine unspezifische Antikörper Färbung durch die Anwendung von 5 % NHS mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe zu blockieren (ca. 30 μl benötigt wird, um die Probe zu decken). Wash Folien in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 Minuten. Fügen Sie die 1° Antikörper (Table of Materials) in 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe verdünnt (etwa 30 μl sollte im Abschnitt), dann 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C in feuchten Kammer inkubieren. Waschen Sie die Objektträger in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min. Hinzufügen den 2 ° c-Antikörper mit 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe verdünnt (etwa 30 μl decken den Bereich), dann 1 h bei RT in feuchten Kammer inkubieren. Waschen Sie die Objektträger in Coplin gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min. Fügen Sie DAPI, verdünnt, um den Vorgaben des Herstellers, in 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer an den hydrophoben Kreis um die Probe dann 2 – 5 min bei RT in der Dunkelheit (30 μl) inkubieren. Waschen Sie die Objektträger in Coplins gefüllt mit PBS 3 Mal für 5 min. Montieren Sie die Folien mit antifade Montage Medien und Deckglas, dann visualisieren Sie die Ergebnisse unter dem Mikroskop. 6. ganze-Montage von Organellen für Immunofluorescent Färbung Vorräte sammeln: Kammer Folie oder konfokale Gericht, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Fixativ, 50 mM NH4Cl in PBS, 0,1 % nicht-ionische Waschmittel in PBS, 5 % NHS mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer, 1 % BSA mit 0,3 % nicht-ionische Reinigungsmittel in PBS, 1° und 2° Antikörper von Interesse, und Counterstains von Interesse. Entfernen Sie vorsichtig so viel Medien möglichst ohne Unterbrechung die organoide Kultur durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, wobei Raum zwischen Medien und Matrix-Gel. Mit einer gestutzten Vornässen mit Medien oder PBS, 1.000 μl Pipettenspitze erarbeiten einen Tropfen (25 – 50 μL) Matrix-Gel, das die Organoid(s) von Interesse enthält und verzichten auf die Mitte der Kammer Folie gut oder konfokale Platte.Hinweis: 33 % Matrix Gel ist keine solide. Es ist eine gallertartige Flüssigkeit, die ähnlich wie eine Götterspeise behandelt, die nicht vollständig gesetzt hat. Eine getrimmte Pipettenspitze mit großer Öffnung verhindert Organellen brechen beim Umsteigen. Ersetzen Sie Organellen in die übergeordnete Kultur bleiben, Medien mit warmen KSFM-basierte Medien. Aspirieren Sie mit dem bloßen Auge oder sezierenden Umfang das überschüssige Medien und Matrix-Gel aus der Kammer-Folie mit einer feinen Spitze Pipette (10 – 200 μL).Hinweis: Es ist optional für die Kammer-Folie mit einer Einhaltung Reagenz vorbehandeln. Platte ein gleiches Volumen der Matrix Gel in einen leeren Brunnen der Kammer Folie als ein optionales Steuerelement, Autofluoreszenz des übrig gebliebenen Matrix zu beobachten. Legen Sie die Kammer-Folie in einem Inkubator 37 ° C für 30-45 min zur Förderung der organoide um das Glas halten und verhindern den Verlust von Proben während Waschen Schritte. Pipettieren langsam zu verhindern Loslösung von Folie, Organellen mit 200 μl 1 X PBS für 5 min bei RT zu waschen, während sanft schütteln. Entfernen Sie die 1 x PBS und Fix mit 200 μL der 4 % Paraformaldehyd für 30 min bei RT unter sanft schütteln. Sicherzustellen Sie, dass das Matrix-Gel nach diesem Schritt klar erscheint.Hinweis: Methanol oder Formalin Fixierung sind ebenfalls möglich. Befestigungsmethode sollte für spezifische Antikörper optimiert werden, wie bestimmte Fixierung Methoden Crosslink Antigene von Interesse vielleicht oder Leuchtstoff-Kennzeichnung-Proteine des Interesses zu stillen. Entfernen Sie das Fixiermittel und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min zu waschen Sie, während sanft schütteln.Hinweis: Die Länge der Waschschritte sollte je nach organoide Größe optimiert werden. Fünf Minuten ist ein ausreichender Ausgangspunkt, aber die Waschschritt kann je nach Bedarf verlängert werden. Autofluoreszenz mit 200 μl 50 mM NH4Cl in 1 X PBS für 30 min bei RT unter sanft schütteln zu stillen.Hinweis: Dieser Schritt stillen Autofluoreszenz von Schmutz in das Lumen der organoide und fluoreszierende Protein-Expression (z. B. GFP), die aus experimentellen Design präsentieren kann. Es sollte enthalten sein, wenn es gewünscht wird, ein Fluorophor in 488 Kanal zu verwenden, sondern übersprungen werden, kann falls gewünscht, GFP-Signal zu erhalten. Entfernen Sie NH4Cl und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln. Permeabilize Organellen in 200 μl von 0,1 % nicht-ionische Waschmittel-100 mit 1 X PBS-Puffer für 30 min bei RT unter sanft schütteln. Entfernen Sie die 0,1 % nicht-ionische Waschmittel-100 in 1 x PBS und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min waschen unter sanft schütteln. Block mit 5 % NHS mit 200 μL von 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel x-100 mit PBS-Puffer und 60 min bei RT inkubieren, während sanft schütteln. Entfernen Sie die blockierenden Puffer und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln. Verdünnen den 1° Antikörper in 1 % BSA mit 0,3 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer und 200 μL der Kammer Folie hinzufügen, dann 1 – 3 Tage bei 4 ° c inkubieren Entfernen Sie 1° Antikörper zu und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln. Verdünnen den 2° Antikörper in 1 % BSA mit 0,3 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer und 200 μL der Kammer Folie hinzufügen, dann 1 – 3 Tage bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren.Hinweis: Die Länge der Inkubationszeiten sollte für organoide Größe und Antikörper optimiert werden. Einige benötigen mehr Zeit, um die organoide durchdringen. Antikörperkonzentration müssen auch optimiert werden. In der Regel 2 X die Konzentration verwendet für Proteinkinase Abschnitte eignet sich für 1° Antikörper und die gleiche Konzentration für Proteinkinase Abschnitte eignet sich für 2° Antikörper. Entfernen Sie 2°-Antikörper zu und waschen Sie zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min unter sanft schütteln. Gegenfärbung Aktin mit Phalloidin und der Zellkern mit DAPI oder Hoechst, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers in 1 % BSA mit 0,3 % verdünnt Triton-X in 1 X PBS. 200 μL Kammer Folie hinzufügen, dann 40 min im Dunkeln bei RT inkubieren. In 200 μl des frischen 1 x PBS oder Montage Medien montieren und sofort Bild (Fluoreszenz sollte erhalten bleiben für bis zu 5 Tage, wenn nicht mehr). Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt.Hinweis: Natriumazid kann hinzugefügt werden, zu Proben, um Kontaminationen zu vermeiden, wenn konfokale Bildgebung nicht leicht zugänglich ist. Hinzufügen eines Clearing-Agents kann Bildgebung verbessert werden. 7. ganze-Montage von Organellen für Assays und fluoreszierende Sonden Hinweis: Es gibt im Handel erhältlichen Tests und Sonden/Fluoreszenzfarbstoffen (Beispiele sind auf der Liste der Materialien enthalten) für den Einsatz auf ganze montierte Organellen zu beobachten, eine Vielzahl von nützlichen Endpunkte19geändert. Das folgende Protokoll ist für das Eindringmittel gekennzeichnet EdU Verbreitung Kit, aber jedes Kit für den Einsatz mit einer gesamten montierte Probe geändert werden kann. Sorgfältig entfernen 50 μL der Medien und ersetzen mit 50 μL von 20 μM 2 x EdU Lösung durch Pipettieren gegen die Seite des Brunnens, wobei Raum zwischen Medien und Matrix Gel arbeiten. 1 – 3 Tage (die von Ihnen gewünschte Zeitspanne für EdU Einarbeitung sollte für Zelltyp Wahl optimiert) bei 4 ° C inkubieren. Führen Sie die Schritte 6,2-6,8 Organellen von Interesse auf eine Kammer Folie oder konfokale Gericht übertragen. Entfernen von PBS und fixieren mit 200 μL von 3,7 % Paraformaldehyd für 30 min bei RT unter sanft schütteln. Sicherstellen, dass die Matrix Gel nach diesem Schritt klar erscheinen. Entfernen Sie das Fixiermittel und zweimal mit 200 μl 1 X PBS für 5 min zu waschen Sie, während sanft schütteln. Entfernen Sie PBS zu, und fügen Sie 200 μL von 0,5 % nicht-ionische Waschmittel-100 mit 1 X PBS-Puffer für 30 min bei RT unter sanft schütteln. 1 x cocktail nach den Vorgaben des Herstellers fluoreszierende Reaktion vorzubereiten. Entfernen Sie 0,5 % nicht-ionische Waschmittel-100 und waschen Sie zweimal mit 200 μL der 3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer für 5 min unter sanft schütteln. Fügen Sie Reaktion Cocktail und inkubieren Sie für 30 min bei RT in der Dunkelheit. Entfernen Sie die fluoreszierende Reaktion cocktail und Waschen einmal mit 200 μL der 3 % BSA mit 1 X PBS-Puffer für 5 min, während sanft schütteln. Gegenfärbung und montieren, indem Sie die folgenden Schritte 6.21 – 6.22 (Abbildung 3D).