A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking

Mohammad A. Ghane; Dina W. Yakout; Angela M. Mabb

doi:10.3791/59048

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

신경과학

Ein High-Content-Assay für die Überwachung der AMPA Rezeptor Menschenhandel

Published: January 28, 2019

doi:

10.3791/59048

Mohammad A. Ghane*¹, Dina W. Yakout*¹, Angela M. Mabb¹

¹Neuroscience Institute,Georgia State University

Summary

Neuronale Erregbarkeit kann durch einen dynamischen Prozess der Endo- und Exozytose von exzitatorischen Ionotropic Glutamat-Rezeptoren moduliert werden. Hier beschriebenen ist ein leicht zugängliche, High-Content Assay zur Quantifizierung der Oberfläche und interne Rezeptor Bevölkerung Pools.

Abstract

Postsynaptischen Rezeptoren von der Zelloberfläche und Frauenhandel ist ein wichtiger Mechanismus, durch den Neuronen ihre Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize modulieren. Die α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säuren (AMPA) Rezeptoren, die für schnelle erregenden synaptischen Übertragung in Neuronen verantwortlich sind, sind von der postsynaptischen Oberfläche dynamisch ändern neuronale Erregbarkeit und verschleppt. AMPA Rezeptor Menschenhandel ist essentiell für synaptische Plastizität und kann bei neurologischen Krankheit gestört werden. Jedoch ignorieren vorherrschenden Ansätze zur Quantifizierung der Rezeptor des Menschenhandels gesamte Rezeptor Pools, sind übermäßig Zeit- und arbeitsaufwendig, oder möglicherweise stören normale Menschenhandel Mechanismen und daher erschweren die Interpretation der gewonnenen Daten. Wir präsentieren einen High-Content-Assay für die Quantifizierung von Oberfläche und interne AMPA-Rezeptor-Populationen in kultivierten primären hippocampal Neuronen mit dual fluoreszierende Immunolabeling und einen fluoreszierenden 96-Well-Mikrotestplatte Nah-Infrarot-Scanner. Dieser Ansatz erleichtert die schnelle Screening von Bulk verinnerlicht und Rezeptor Dichte bei gleichzeitiger Minimierung der Sample-Material der Oberfläche. Unsere Methode hat jedoch Einschränkungen in einzellige Auflösung zu erhalten oder die Durchführung von live Cell Imaging. Schließlich kann dieses Protokoll zugänglich zu anderen Rezeptoren und verschiedenen Zelltypen, die richtigen Anpassungen und Optimierung zur Verfügung gestellt werden.

Introduction

Das Ausmaß und die zeitliche Dynamik der neuronalen Erregbarkeit ist weitgehend abhängig von der Verfügbarkeit und der Zusammensetzung der Oberfläche Rezeptor Bevölkerungen, die elektrochemische Signale transduzieren. Während die Synthese von neuen Rezeptoren (oder Rezeptor-Untereinheiten) in der Regel ein energetisch teuer und relativ langwierigen Prozess ist, bieten eine Vielzahl von zellulären Maschinerie widmet sich der Endo und Exozytose der vorhandenen Rezeptoren eine Möglichkeit für ihre schnelle Eingliederung und Entfernung zur und von der Membran-¹. Daher ist neben der transcriptional und translational Regelung von Rezeptoren, posttranslationale Rezeptor Handel eine wichtige Modulator der neuronalen Erregbarkeit.

Synaptische Plastizität oder die wechselnden Stärke der Verbindungen zwischen den Neuronen mit Erfahrung, wird gedacht, um bilden die Grundlage für lernen und Gedächtnis²^,³. Die Stärkung und Schwächung der Synapsen im Laufe der Zeit bezeichnet Langzeitpotenzierung (LTP) und Langzeitdepression (LTD), können bzw. moduliert werden, durch den Handel mit α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) Rezeptoren ⁴ ^, ⁵. AMPA-Rezeptoren sind Heterotetramers bestehend aus vier Untereinheiten (GluA1-4) und die meisten schnell exzitatorische synaptische Übertragung im Gehirn⁶zu vermitteln. So ist Neuron Erregbarkeit zum großen Teil eine Funktion der Menge der AMPA-Rezeptoren an der postsynaptischen Oberfläche zur Verfügung, um durch Glutamat aktiviert werden. LTD ist häufig verbunden mit einer Zunahme der AMPA-Rezeptor Endozytose, LTP überwiegend verbunden mit einem Anstieg der AMPA-Rezeptor Exozytose. Postsynaptischen Oberflächenexpression von AMPA-Rezeptoren erfordert Endosomal Lieferung steht Proteinen, wo dann Fusion mit der Plasmamembran in einem Kalzium-abhängigen Weise⁷^,⁸^,⁹^, tritt ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. gibt es auch eine Vielzahl von Mechanismen, die aktivitätsabhängige AMPA-Rezeptor Endozytose regulieren. Ein Beispiel dafür ist über das unmittelbare gen Arc/Arg3.1 (Arc). Bei den anderen Funktionen¹⁵, nennt man Arc metabotropen Glutamat-Rezeptor (mGluR) zu vermitteln-abhängige LTD durch Förderung der AMPA-Rezeptor Endozytose durch seinen Bindungspartner, darunter die endocytic Proteine AP-2, Endophilin-3 und Dynamin-2 ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹, um Clathrin-coated pits²⁰^,²¹. Verinnerlichte AMPA-Rezeptoren können zurück zu der Plasmamembran recycelt oder für Abbau²²^,²³vorgesehen sind.

Wichtig ist, trägt die Untereinheit Zusammensetzung des AMPA-Rezeptoren auf ihrer Menschenhandel Dynamik²⁴. Von großer Bedeutung ist die intrazelluläre C-terminale Domäne der Untereinheiten, wo die Mehrheit der posttranslationale Modifikationen und Menschenhandel im Zusammenhang mit Protein-Wechselwirkungen auftreten. GluA1 und GluA4-Untereinheit-haltigen AMPA-Rezeptoren sind besonders geeignet, als Opfer von Menschenhandel an der Zelloberfläche bei LTP, teilweise aufgrund des Vorhandenseins von ihrer PDZ-Liganden, ~ 90 Aminosäure-Sequenzen, die Membran über Interaktionen mit verschiedenen PDZ Verankerung zu fördern Domäne-haltige Proteine²⁵^,²⁶. Auf der anderen Seite neigen AMPA-Rezeptoren mit GluA2 und ohne GluA1 oder GluA4, konstitutiv verschleppt werden, sondern akkumulieren intrazellulär mit synaptischen Aktivität²⁷. GluA2 Untereinheiten unterziehen RNA bearbeiten, die neben der Förderung der Bindung in das endoplasmatische Retikulum²⁸, die Kanal-Pore undurchlässig für Kalzium²⁹, macht weitere Verwicklung Untereinheit-spezifische Menschenhandel als ein wichtiger Vermittler von neuronalen Homöostase und Plastizität. Interessanterweise, Störung des Ubiquitin-abhängige Arc Abbau nachweislich GluA1 Endozytose und erhöhen die Oberflächenexpression von GluA2 Untereinheit-haltigen AMPA-Rezeptoren nach Induktion der mGluR-LTD mit der ausgewählten Gruppe I mGluR-agonist (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), darauf hinweist, dass noch viel über die Mechanismen und die Rolle der Untereinheit-spezifische AMPA-Rezeptor des Drogenhandels³⁰erlernt werden.

Methoden zur Beobachtung von Veränderungen der Oberflächenexpression von Rezeptoren sind oft umständlich, zeitaufwendig oder vorstellen unnötig verwirrt. Biotin-based Assays sind allgegenwärtig und im Handel erhältlichen Ansatz. Affinitätsreinigung biotinylierte Oberfläche Rezeptoren stellt ein solches Beispiel, aber die Notwendigkeit zur Durchführung von Elektrophorese eine große Menge an Probenmaterial erfordert und dem Screening von mehreren Behandlungen einen übermäßig langen Rendern können ³¹zu verarbeiten. Erweiterungen des Assays, wo mehrere Zeitpunkte der Kennzeichnung und Immunperoxidase durchgeführt werden, um die allmähliche Verschlechterung der ein erstes Signal zu quantifizieren, in ähnlicher Weise vernachlässigen die Zugabe von neu – oder recycelten-Rezeptoren auf der Zelle Oberfläche und nur verschärfen die Zeit und die Anforderungen an das Material.

Andere Ansätze machen Gebrauch von Chimären Konstrukten oder die Zugabe von fluoreszierenden Tags Rezeptor Menschenhandel³²beobachten, manchmal mit live cell imaging³³^,³⁴. Während potenziell einflussreiche, beeinflussen diese Designs die normalen Menschenhandel Muster der Rezeptoren durch Mutationen oder dramatische Veränderungen im Molekulargewicht in dieser Proteine eingeführt. Die Verwendung von Farbstoffen, die subzelluläre Kompartimente zu kennzeichnen, indem Sie auf niedrige pH-Wert³⁴^,³⁵ sind unspezifisch und machen die Unterscheidung zwischen verschiedenen intrazellulären Kompartimenten wichtig für Rezeptor Menschenhandel (z. B.. Lysosomen und Proteasomen) schwierig. Zu guter Letzt die Verwendung der konfokalen Mikroskopie NS1 Rezeptoren mit Marker, die mit Menschenhandel und Erniedrigung, wie Endosomal Proteine oder Clathrin, während potenziell nützliche Einblicke in spezifische Lokalisierung mit visualisieren subzelluläre Auflösung, sind Zeit-, Arbeits- und kostenintensiv aufgrund der Notwendigkeit der Analyse individuell jede Zelle und das Erfordernis der konfokalen oder Super-Auflösung Mikroskopie.

Hier zeigen wir einen High-Content-Rezeptor Menschenhandel-Assay, der kompatibel mit neuronalen Primärkultur Vorbereitungen³⁰ist. Diese Methode kennzeichnet separat die Oberfläche und intrazellulären Rezeptor-Pools von festen Neuronen, ermöglicht die Darstellung von Daten in Relation zum normalisierten Fläche oder verinnerlichten Rezeptordichte auf die Gesamtdichte für diesen Rezeptor. High-Content Natur dieser Methode eignet sich besonders für das screening von mehreren Behandlungen und/oder Genotypen in einem kurzen Zeitrahmen und erfordert nur Standardzelle kultiviert und Antikörper Inkubationszeit Know-how.

Kurz, primäre Neuronen sind in standard 96-Well-Mikroplatten angebaut und dann behandelt wie experimentelles Design vorgibt, mit Primärantikörper inkubiert, gewaschen und fixiert. Zellen werden dann mit einem sekundären Antikörper Oberfläche Rezeptoren, gefolgt von einem anderen Fixierung Schritt beschriften inkubiert. Permeabilisierung dann auftritt und eine zweite Sekundärantikörper wird verwendet, um interne Rezeptor Pools zu beschriften. Zu guter Letzt werden Zellen abgebildet mit einem Infrarot-fluoreszierende Mikrotestplatte Scanner, um die integrierte Bevölkerungsdichte jeder Rezeptor zu quantifizieren. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung unserer High-Content-Assay im Vergleich zu einem traditionellen Biotinylierungen-Assay.

Während das Protokoll angeboten, hier ist optimiert und speziell für Handel mit primären hippocampal Neuronen Kulturen AMPA-Rezeptor, werden für unterschiedliche Rezeptoren in einer Vielzahl von Zelltypen dieses Verfahren könnte in der Theorie, erweitert und angepasst.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Georgia State University genehmigt. 1. Vorbereitung des primären Hippocampal Neuronen (in Laminar-Flow-Haube) Isolieren von primären hippocampal Neuronen aus gemischten Sex postnatale Tag (P) 0-1 Mäusen wie oben beschrieben36. Platte Neuronen in 96-Well-Poly-D-Lysin beschichtete Mikrotiterplatten bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen pro Bohrloch. Bereiten Sie Medien für die Fütterung der Neuronen durch Zugabe von 10 mL 50 x B-27, 5 mL 100 x Glutamin, 242 µL 10 mg/mL 5-Fluoro-2-Deoxyuridine (FUDR) und 10 µL von 10 mg/mL Gentamycin bis 485 mL der neuronalen Medien (siehe Tabelle der Materialien). Feed Neuronen wie oben beschrieben36 durch entfernen die Hälfte (100 µL) der bereits vorhandenen Medien (bezeichnet als konditionierte Medien, die Bestandteile enthält, die neuronale überleben unterstützen) aus jedem Brunnen und ersetzen mit 100 µL 37 ° C vorgewärmt Medien alle 3-4 Tage vorbereitet in Schritt 1.3. Speichern Sie die konditionierten Medien aus jeder Fütterung bei 4˚C für Schritt 2.3. 2. Messung der AMPA-Rezeptor Menschenhandel als Reaktion auf DHPG (in Laminar-Flow-Haube) Bereiten Sie am Tag In Vitro (DIV) 14, eine 500 µL Stammlösung von Tetrodotoxin (TTX) in einer Konzentration von 2 mM mit Zellkultur Grade Wasser.Vorsicht: TTX ist ein Nervengift. Behandeln Sie vorsichtig und vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Mit einer Multi-Kanal-Pipette, 100 µL aus jeder Quelle des 96-Well Mikrotestplatte von Neuronen zu entfernen und die Medien pool. Fügen Sie 2 µL der TTX Vorratslösung zu 1 mL der gepoolten konditionierten Medien aus Schritt 2.2 zum Erstellen einer 4 µM-Lösung von TTX. Wenn nicht genug gepoolte konditionierte Medien vorhanden ist, verwenden Sie einige der gespeicherten konditionierten Medien aus Schritt 1.4. Behandlung von Neuronen mit 100 µL/Well 4 µM-Lösung von TTX aus Schritt 2.3. Legen Sie die Mikrotestplatte in einer 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° C für 4 h. Legen Sie eine sterile Glas Pasteur pipette auf eine Saugleitung und befestigen Sie eine sterile 200 µL Pipette Ende an der Spitze der Pipette. Entfernen Sie die Medien gut vorsichtig voneinander. Berühren Sie unten die Mikrotestplatte befinden sich die Neuronen. Jedes gut 200 µL der Raumtemperatur neuronalen Medien hinzufügen. Inkubieren Sie die Mikrotestplatte bei Raumtemperatur, für 15 min. Inkubation in 5 % CO2 bevorzugte, aber nicht notwendig ist. (3) Immunolabelling (in Laminar-Flow-Haube) Eine Verdünnung von 1: 150 des Antikörpers Anti-GluA1 oder Anti-GluA2 in neuronalen Medien vorbereiten. Entfernen Sie die neuronalen Medien im Schritt 2.6 hinzugefügt. Entsprechende Vertiefungen für 20 min bei Raumtemperatur erlauben Antikörperbindung fügen Sie 50 µL der Anti-GluA1 oder Anti-GluA2 Antikörper Lösungen hinzu. Die sekundäre Antikörper nur Kontroll-Vertiefungen 50 µL der neuronalen Medien hinzufügen. Entfernen Sie die Antikörper-Lösungen im Schritt 3.2 hinzugefügt. Waschen Sie die Mikrotestplatte 3 Mal mit 100 µL/Well Raumtemperatur neuronalen Medien, alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Machen Sie eine 50 mM-Stammlösung der DHPG in neuronalen Medien oder Kultur Grade Zellwasser. Wirbel die Lösung kurz für die DHPG vollständig zu lösen. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu, am selben Tag des Experiments. Vermeiden Sie die Verwendung von alten oder aufgetaut Lösungen. Verdünnen der Stammlösung in neuronalen Medien zu 1: 500, 100 µM Lösung zu machen. Entfernen Sie die vorhandenen Medien aus jedem Brunnen. 100 µL/Well der Vorratslösung 100 µM DHPG aus Schritt 3.5 hinzufügen. Inkubieren Sie die Mikrotestplatte im Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO2 für 10 min. Die DHPG Lösung im Schritt 3.6 hinzugefügt entfernen und Hinzufügen von 100 µL/Well neuronalen Medien. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Legen Sie die Mikrotestplatte im Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO2 für 5 Minuten. Fügen Sie die Saccharose um die 4 % paraformaldehyde/4% Saccharoselösung mit PBS-Puffer am selben Tag des Experiments zu machen. Vermeiden Sie die Verwendung von alten oder aufgetaut Lösungen. Entfernen Sie das Medium in Schritt 3.7 hinzugefügt. 100 µL/Well 4 % paraformaldehyde/4% Saccharose-Lösung hinzufügen. Wiederholen Sie die Schritte 3,6-3,8 für jede zusätzliche Zeit-Punkt. Nach Abschluss inkubieren Sie der Mikrotestplatte bei 4 ° C für 20 min.Vorsicht: Paraformaldehyd Bestände in einer Dampfhaube zu behandeln. Fixiermittel aus Schritt 3.8 entfernen und Hinzufügen von 100 µL/Well des kalten 1 X DPBS. DPBS zu entfernen. Fügen Sie 150 µL/Well blockieren Puffer (eine Ready-to-Use-Formulierung in TBS, siehe Tabelle of Materials) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 90 min. Alternativ, über Nacht bei 4 ° c inkubieren 4. Kennzeichnung Oberfläche Rezeptoren Bereiten Sie eine 1:1500 Verdünnung der 680RD Ziege Anti-Maus IgG Sekundärantikörper in blocking-Puffer. Entfernen Sie blockierende Puffer aus Schritt 3.10. Fügen Sie 50 µL/Well der Sekundärantikörper Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min. halten die Mikrotestplatte vor Licht geschützt, sobald der Sekundärantikörper hinzugefügt werden. Achten Sie darauf, auch weiterhin die Mikrotestplatte während nachfolgende Inkubationen vor Licht zu schützen. Entfernen Sie die Lösung aus Schritt 4.2. Fügen Sie 100 µL/Well TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6) und bei Raumtemperatur inkubieren Sie, für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 weitere Male. Entfernen Sie TBS aus Schritt 4.3. 100 µL/Well von 4 % paraformaldehyde/4% Saccharose in PBS hinzufügen und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. 4.4 Schritt entfernen Sie Lösung. Fügen Sie 100 µL/Well TBS und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. 5. Kennzeichnung der verinnerlichten Rezeptor-Bevölkerung Bereiten Sie TBS mit 0,2 % Saponin vor. Wirbel die Lösung kurz auf das Saponin-Pulver vollständig zu lösen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2 µm-Filter alle Partikel zu entfernen, die Auto-Fluoreszenz verursachen könnten. Fügen Sie 150 µL TBS, 0,2 % Saponin enthalten und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. Saponin-Lösung aus Schritt 5.2 entfernen und Hinzufügen von 150 µL/Well-blocking-Puffer. Bei Raumtemperatur für 90 min inkubieren. Bereiten Sie eine 1:1500 Verdünnung der 800CW Esel Anti-Maus IgG Sekundärantikörper in blocking-Puffer. Blockierende Puffer aus Schritt 5.3 entfernen und Hinzufügen von 50 µL/Well der Sekundärantikörper Lösung. Bei 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie 100 µL/Well TBS und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 weitere Male. 6. Bildgebung und Analyse Bild der 96-Well-Mikrotestplatte mit ein Infrarot-Laser imaging-System gemäß Anweisungen des Herstellers. Legen Sie die Scanauflösung 84 µm, die Scan-Qualität, Medium und den Fokus entsprechend die Basishöhe der verwendeten 96-Well-Mikrotestplatte ausgeglichen. Klicken Sie auf “Image Studio” Menü-Taste → exportieren → Bild für Digitalmedien → Export Bilder mit einer Auflösung von 300 dpi im TIFF-Format. Download Bild J “Fidschi” bei https://imagej.net/Fiji/Downloads Bild in Bild J “Fidschi” öffnen. Split-Farbkanäle durch Klicken auf das Menü “Bild”→ Split Farbkanäle. Öffnen Sie den ROI-Manager von “Analysieren” → “Tools”. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen “Beschriftungen” in den ROI-Manager, um die Kreise mit Zahlen beschriften. Im roten Kanal (680 nm Oberfläche Rezeptor Pool), wählen Sie die Region von Interesse (ROI) durch die Auswahl der Kreisfunktion und Zeichnen eines Kreises, der die erste Bohrung genau passt. Drücken Sie Strg + T. Ziehen Sie den Kreis zum nächsten gut und drücken Sie Strg + T. wiederholen, bis alle Brunnen eingekreist sind. Der ROI-Manager klicken Sie auf “Messen”. Wählen Sie die Werte, die erscheinen und kopieren Sie sie auf einem Arbeitsblatt. Klicken Sie auf den grünen Kanal (800 nm interne Rezeptor Pool) und dann umsetzen Sie der ausgewählten ROIs aus Schritt 6,6 auf das Bild. Der ROI-Manager klicken Sie auf “Messen”. Wählen Sie die Werte, die erscheinen und kopieren Sie sie auf einem Arbeitsblatt. Berechnen Sie die durchschnittliche integrierte Dichtewerte von sekundären nur Brunnen steuern. Subtrahieren Sie die integrierte Dichtewerte für jede experimentelle Brunnen aus der sekundären nur Steuerung integriert Dichte Durchschnittswerte für die Oberfläche Rezeptor-Pool. Wiederholen Sie diesen Schritt für den internen Rezeptor-Pool. Berechnen Sie Veränderungen der Oberfläche Rezeptor-Expression mit Rs/rt, wo Rs steht für die integrierte Dichte der Oberfläche Rezeptoren und Rt für die integrierte Dichte der Oberfläche Rezeptoren + integrierte Dichte der internen Rezeptoren.

Representative Results

Bogen/Arg3.1 beschleunigt AMPA-Rezeptor Endozytose durch Interaktion mit AP-2, Endophilin-3 und Dynamin-216,18 nach mGluR Aktivierung37. In der Arc Knock-in Maus (ArcKR) sind Lysines 268 und 269 in der Arc-Protein zu Arginin, mutiert die Arc Ubiquitination behindert. Dies beeinträchtigt Proteasom-abhängige Umsatz von Arc und verlängert die Halbwertszeit in Neuronen21,30. In diesem Experiment wurde das Fortbestehen des Bogens bei der Regulierung der AMPA Rezeptor Menschenhandel mit High-Content AMPA-Rezeptor des Drogenhandels Assay untersucht. Neuronen wurden mit Na+ -Kanal-Blocker TTX, behandelt die Aktionspotentiale hemmt und reduziert Arc Level38, gefolgt von DHPG, die Arc-Übersetzung und Ubiquitination37,39induziert. Oberfläche und verinnerlichten Pools des GluA1 (Abb. 2A) und GluA2-haltigen (Abbildung 3A) AMPA-Rezeptor-Untereinheiten wurden gemessen bei 5-15 min nach DHPG auswaschen. Dieses besondere Experiment verwendet drei technische Wiederholungen von 3 unabhängigen Experimenten. ArcKR Neuronen zeigte erhöhte GluA1 Endozytose Behandlung mit DHPG im Vergleich zu WT Neuronen, ein Effekt, der nicht gesehen wurde, wenn Neuronen mit TTX nur (Abb. 2 b) behandelt wurden. Oberflächenexpression von GluA2 Untereinheiten wurde in kurzer Zeitpunkte im Vergleich zum WT Neuronen (Abb. 3 b), zeigt eine mögliche Untereinheit Ersatz30deutlich erhöht. Einige Brunnen wurden mit Sekundärantikörper nur für Hintergrundfluoreszenz, verursacht durch die unspezifische Bindung-Steuerelement behandelt. Abbildung 1: Vergleich der AMPA-Rezeptor High-Content Menschenhandel Assay, der Rezeptor Biotinylierungen Assay. Der High-Content Menschenhandel Assay verbraucht weniger Zeit und Ressourcen, die im Vergleich zu den standard Biotinylierungen-Assay. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Oberfläche und interne Populationen von GluA1 AMPA-Rezeptor-Untereinheiten in WT und ArcKR hippocampal Neuronen. (A) Fläche (sGluA1) und verinnerlichten (iGluA1) GluA1-haltigen AMPA Rezeptor-Untereinheiten in WT und ArcKR hippocampal Neuronen bei 5-15 min nach DHPG auswaschen. Im Vergleich zu WT, haben ArcKR Neuronen einen weiteren Rückgang im sGluA1-haltigen AMPA-Rezeptor Pool 5 und 15 min nach DHPG auswaschen. (B) Graph stellt Oberfläche Fluoreszenz auf der gesamten Fluoreszenzintensität normalisiert. Statistische Vergleiche wurden mit einem One-Way ANOVA, gepaarten und ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt. p ≤ 0,05; n = 3 Technische Wiederholungen von 3 unabhängigen Experimenten. Werte stehen für Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Wand, M. J. Et Al. 201830geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Oberfläche und interne Populationen von GluA2 AMPA-Rezeptor-Untereinheiten in WT und ArcKR hippocampal Neuronen. (A) die gleichen Versuchsbedingung wie Abbildung 2. Im Vergleich zu WT, haben ArcKR Neuronen eine Erhöhung im sGluA2-haltigen AMPA-Rezeptor Pool 5 min nach DHPG auswaschen. (B) Graph stellt Oberfläche Fluoreszenz auf der gesamten Fluoreszenzintensität normalisiert. Statistische Vergleiche wurden mit One-Way ANOVA, gepaarten und ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt. p ≤ 0,05; n = 3 Technische Wiederholungen von 3 unabhängigen Experimenten. Werte stehen für Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Wand, M. J. Et Al. 201830geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

AMPA-Rezeptoren sind eine Ionotropic Glutamat Rezeptor-Subtyp, das integral für neuronale Funktionen ist die Synapse Bildung, Synapse Stabilität und synaptische Plastizität enthalten. AMPA-Rezeptor Störungen knüpft an mehreren neurologischen Störungen²⁴ und gelten als attraktive Medikament Ziele⁴⁰. Zum Beispiel haben Studien gezeigt, dass eines der frühesten Anzeichen der Alzheimer-Krankheit (AD) Synapse Verlust und synaptischen AMPA-Rezeptor Level⁴¹^,⁴²reduziert. Faszinierenderweise beeinträchtigt Zugabe von Amyloid-ß Oligomere Oberfläche GluA1-haltigen AMPA-Rezeptor-Expression an Synapsen⁴³. Weiter reguliert unten-Status Epilepticus GluA2 mRNA und Protein in hippocampal Neuronen vor ihrem Tod⁴⁴. Zusammenhang mit ineffizienten GluA2 Q/R Website-RNA bearbeiten in Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), TAR DNA-bindende Protein (TDP-43) Pathologie, molekulare Anomalie ALS-spezifische⁴⁵.

High-Content AMPA-Rezeptor des Drogenhandels Assay bietet ein wirksames Mittel zur Messung von Massenänderungen in Rezeptor Menschenhandel Profile innerhalb eines neuronalen Netzes in Reaktion auf verschiedene Faktoren, verbrauchen viel weniger Zeit- und Materialaufwand als alternative Verfahren. Ein einzelnes 96-Well-Mikrotestplatte bietet zahlreiche Brunnen zum Ausführen mehrerer technischer repliziert und steuert für die verschiedenen experimentellen Bedingungen in der gleichen Platte. Die geringe Panzerung Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/gut im Vergleich zu den 5 x 10⁵ Zellen/Well-Dichte reduziert die Anzahl der Tiere und Materialien für jedes Experiment (Abbildung 1). Die Infrarot-Scanner kann gleichzeitig bis zu sechs 96-Well-Mikroplatten Bild. Der Test kann auch zu einem 384-Well Mikrotestplatte⁴⁶, wird speziell wertvoll, wenn der Test auf wertvollen Proben ausgeführt wird, die schwer zu bekommen sind teuer in der Kultur (z.B. Humanproben und induzierte pluripotente Stammzellen) oder, geändert werden. Der gesamte Test kann abgeschlossen und am selben Tag, spart wertvolle Zeit (Abbildung 1) analysiert werden.

Für erfolgreiche und effiziente Durchführung des Assays müssen einige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, die DHPG-Lösung am selben Tag der Neuron Behandlung vorzubereiten. Nicht wiederverwenden Sie oder frieren Sie DHPG Aktien ein. Die 4 % paraformaldehyde/4% Saccharose in PBS-Lösung sollte auch am selben Tag des Experiments frisch zubereitet. Zweitens: Kontroll-Vertiefungen mit TTX nur behandelt oder Fahrzeug sind erforderlich, um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte spezifisch auf die Behandlung sind. Es ist auch entscheidend für Brunnen behandelt nur die sekundäre Antikörper Steuerung für Hintergrundfluoreszenz produziert durch die unspezifische Bindung enthalten. Beachten Sie, dass der zweite Schritt der Fixierung (folgende Auswaschung der Sekundärantikörper) Schlüssel zur Verringerung der Sekundärantikörper Hintergrundeffekte und wirksame Kennzeichnung von Rezeptor-Untereinheiten zu erreichen ist.

Kompromisse und Einschränkungen, gibt es wie bei jeder Methode. Dieser Test bietet keine einzelne Zelle (oder subzellulären) Auflösung und erlaubt keine Echtzeit-Verfolgung des Rezeptors Menschenhandel wie andere Methoden³²^,³³^,³⁵. Darüber hinaus muss während des Schritts Permeabilisierung der Neuronen, richtige darauf geachtet werden, wie diese Methode empfindlich gegen das Austreten von intrazellulären Komponenten bei übermäßigen Permeabilisierung werden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Zachary Allen für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Whitehall-Stiftung (Grant 2017-05-35) und Cleon C. Arrington Research Initiation Grant Program (RIG-93) U.V.M. M.A.G. und D.W.Y. wurden beide von einem Georgia State University Neurogenomics 2CI Fellowship unterstützt.

Materials

Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal	EMD Millipore	Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2	ThermoFisher Scientific	Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L)	Li-COR Biosciences	Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Li-COR Biosciences	Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15
(RS)-3,5-DHPG	Tocris Bio-Techne	Cat#0342
Tetrodotoxin Citrate (TTX)	Tocris Bio-Techne	Cat#1069
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich	Cat#P7280-5X5MG
Saponin	ACROS Organics	Cat# 419231000
B-27 Supplement (50 X), Serum Free	Gibco	Cat#17504044
Glutamax Supplement	Gibco	Cat#35050061
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR)	Sigma-Aldrich	Cat#F0503
Gentamycin (10 mg/ml)	Gibco	Cat#15710064
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified	Electron Microscopy Sciences	Cat#19210
Sucrose (EP/BP/NF)	FisherScientific	Cat#S2500GM
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	Li-COR	Cat#927-50003	Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol
Cell Culture Grade Water	HyClone	Cat#SH30529.02
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	Cat#14190250
Neurobasal Medium, minus phenol red	Gibco	Cat#12348017	Referred to as "neuronal Media" in the protocol
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile	Corning	Cat#431219
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates	Corning	Cat#3603
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070
FIJI (Fiji is Just ImageJ)	NIH	http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285
Odyssey CLx imaging system	Li-COR Biosciences

References

Kennedy, M. J., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 29, 325-362 (2006).
Hebb, D. O. . The organization of behavior; a neuropsychological theory. , (1949).
Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B. 369 (1633), 20130288 (2014).
Collingridge, G. L., Isaac, J. T., Wang, Y. T. Receptor trafficking and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 5 (12), 952-962 (2004).
Newpher, T. M., Ehlers, M. D. Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains. Neuron. 58 (4), 472-497 (2008).
Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 461-469 (2012).
Correia, S. S., et al. Motor protein-dependent transport of AMPA receptors into spines during long-term potentiation. Nature Neuroscience. 11 (4), 457-466 (2008).
Wang, Z., et al. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135 (3), 535-548 (2008).
Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 defines a domain for activity-dependent exocytosis in dendritic spines. Cell. 141 (3), 524-535 (2010).
Hussain, S., Davanger, S. Postsynaptic VAMP/Synaptobrevin Facilitates Differential Vesicle Trafficking. of GluA1 and GluA2 AMPA Receptor Subunits. PLoS One. 10 (10), 0140868 (2015).
Wu, D., et al. Postsynaptic synaptotagmins mediate AMPA receptor exocytosis during LTP. Nature. 544 (7650), 316-321 (2017).
Jurado, S., et al. LTP requires a unique postsynaptic SNARE fusion machinery. Neuron. 77 (3), 542-558 (2013).
Arendt, K. L., et al. Calcineurin mediates homeostatic synaptic plasticity by regulating retinoic acid synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), E5744-E5752 (2015).
Ahmad, M., et al. Postsynaptic complexin controls AMPA receptor exocytosis during LTP. Neuron. 73 (2), 260-267 (2012).
Bramham, C. R., Worley, P. F., Moore, M. J., Guzowski, J. F. The immediate early gene arc/arg3.1: regulation, mechanisms, and function. The Journal of Neuroscience. 28 (46), 11760-11767 (2008).
Chowdhury, S., et al. Arc/Arg3.1 interacts with the endocytic machinery to regulate AMPA receptor trafficking. Neuron. 52 (3), 445-459 (2006).
Waung, M. W., Huber, K. M. Protein translation in synaptic plasticity: mGluR-LTD, Fragile X. Current Opinion in Neurobiology. 19 (3), 319-326 (2009).
Wall, M. J., Correa, S. A. L. The mechanistic link between Arc/Arg3.1 expression and AMPA receptor endocytosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 77, 17-24 (2018).
DaSilva, L. L., et al. Activity-Regulated Cytoskeleton-Associated Protein Controls AMPAR Endocytosis through a Direct Interaction with Clathrin-Adaptor Protein. eNeuro. 2 (3), (2016).
Carroll, R. C., et al. Dynamin-dependent endocytosis of ionotropic glutamate receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (24), 14112-14117 (1999).
Mabb, A. M., et al. Triad3A regulates synaptic strength by ubiquitination of Arc. Neuron. 82 (6), 1299-1316 (2014).
Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28 (2), 511-525 (2000).
Petrini, E. M., et al. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation. Neuron. 63 (1), 92-105 (2009).
Henley, J. M., Wilkinson, K. A. Synaptic AMPA receptor composition in development, plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 17 (6), 337-350 (2016).
Hayashi, Y., et al. Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII: requirement for GluR1 and PDZ domain interaction. Science. 287 (5461), 2262-2267 (2000).
Sheng, N., et al. LTP requires postsynaptic PDZ-domain interactions with glutamate receptor/auxiliary protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), 3948-3953 (2018).
Lee, S. H., Simonetta, A., Sheng, M. Subunit rules governing the sorting of internalized AMPA receptors in hippocampal neurons. Neuron. 43 (2), 221-236 (2004).
Greger, I. H., Khatri, L., Kong, X., Ziff, E. B. AMPA receptor tetramerization is mediated by Q/R editing. Neuron. 40 (4), 763-774 (2003).
Sommer, B., Kohler, M., Sprengel, R., Seeburg, P. H. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gated channels. Cell. 67 (1), 11-19 (1991).
Wall, M. J., et al. The Temporal Dynamics of Arc Expression Regulate Cognitive Flexibility. Neuron. 98 (6), 1124-1132 (2018).
Mammen, A. L., Huganir, R. L., O’Brien, R. J. Redistribution and stabilization of cell surface glutamate receptors during synapse formation. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7351-7358 (1997).
Shi, S. H., et al. Rapid spine delivery and redistribution of AMPA receptors after synaptic NMDA receptor activation. Science. 284 (5421), 1811-1816 (1999).
Zhang, Y., Cudmore, R. H., Lin, D. T., Linden, D. J., Huganir, R. L. Visualization of NMDA receptor-dependent AMPA receptor synaptic plasticity in vivo. Nature Neuroscience. 18 (3), 402-407 (2015).
Hayashi, A., Asanuma, D., Kamiya, M., Urano, Y., Okabe, S. High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons. Neuropharmacology. 100, 66-75 (2016).
Ashby, M. C., Ibaraki, K., Henley, J. M. It’s green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends in Neuroscience. 27 (5), 257-261 (2004).
Correa, S. A., Muller, J., Collingridge, G. L., Marrion, N. V. Rapid endocytosis provides restricted somatic expression of a K+ channel in central neurons. Journal of Cell Science. 122, 4186-4194 (2009).
Waung, M. W., Pfeiffer, B. E., Nosyreva, E. D., Ronesi, J. A., Huber, K. M. Rapid translation of Arc/Arg3.1 selectively mediates mGluR-dependent LTD through persistent increases in AMPAR endocytosis rate. Neuron. 59 (1), 84-97 (2008).
Shepherd, J. D., et al. Arc/Arg3.1 mediates homeostatic synaptic scaling of AMPA receptors. Neuron. 52 (3), 475-484 (2006).
Klein, M. E., Castillo, P. E., Jordan, B. A. Coordination between Translation and Degradation Regulates Inducibility of mGluR-LTD. Cell Reports. , (2015).
Chang, P. K., Verbich, D., McKinney, R. A. AMPA receptors as drug targets in neurological disease–advantages, caveats, and future outlook. European Journal of Neuroscience. 35 (12), 1908-1916 (2012).
Hsieh, H., et al. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 52 (5), 831-843 (2006).
DeKosky, S. T., Scheff, S. W. Synapse loss in frontal cortex biopsies in Alzheimer’s disease: correlation with cognitive severity. Annals of Neurology. 27 (5), 457-464 (1990).
Gu, Z., Liu, W., Yan, Z. {beta}-Amyloid impairs AMPA receptor trafficking and function by reducing Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II synaptic distribution. Journal of Biological Chemistry. 284 (16), 10639-10649 (2009).
Grooms, S. Y., Opitz, T., Bennett, M. V., Zukin, R. S. Status epilepticus decreases glutamate receptor 2 mRNA and protein expression in hippocampal pyramidal cells before neuronal death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (7), 3631-3636 (2000).
Yamashita, T., Kwak, S. The molecular link between inefficient GluA2 Q/R site-RNA editing and TDP-43 pathology in motor neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Brain Research. 1584, 28-38 (2014).
Huang, H. S., et al. Topoisomerase inhibitors unsilence the dormant allele of Ube3a in neurons. Nature. 481 (7380), 185-189 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Ghane, M. A., Yakout, D. W., Mabb, A. M. A High-content Assay for Monitoring AMPA Receptor Trafficking. J. Vis. Exp. (143), e59048, doi:10.3791/59048 (2019).