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면역학 및 감염병학

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

여기, 우리가 현재 높게 병원 성 바이러스 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군 coronaviruses의 스파이크 단백질을 통합 하는 BSL-2 설정에 pseudotyped 입자를 생성 하는 프로토콜. 이러한 pseudotyped 입자 포함 대상 호스트 세포에 바이러스 항목의 정량화를 허용 luciferase 취재 원 유전자.

Abstract

코로나 (CoV) 스파이크 (S) 융해 단백질을 생성 하는 프로토콜 목적 pseudotyped 입자 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 코어와 luciferase 기자와, 널리 HEK 293T의 간단한 transfection 절차를 사용 하 여 셀 라인. 일단 형성 하 고 프로듀서 셀에서 발표,이 pseudovirions luciferase 취재 원 유전자를 통합 합니다. 포함 이후 분리 코로나 스파이크 그들의 표면에 단백질, 입자 항목 단계에 대 한 그들의 네이티브 코로나 바이러스 대응 처럼 행동. 이와 같이, 그들은 주인 세포로 바이러스 성 항목을 공부에 대 한 네이티브 virions의 우수한 대리 모 알선입니다. 성공적인 항목 및 대상 세포로 감염, luciferase 기자 호스트 세포 게놈으로 통합 되 고 표현 된다. 간단한 luciferase 분석 결과 사용 하 여, 불리고 셀 수 있습니다. 쉽게 측정할 수 있습니다. 절차의 중요 한 장점은 biosafety에 수행할 수는 높게 병원 성 coronaviruses 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (메-CoV) 등 작업에 필요한 BSL-3 시설 대신 2 (BSL-2) 시설 수준 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 (SARS-CoV) 속한 클래스와 같은 바이러스 성 융해 단백질의 세 클래스 나 인플루엔자 조류 (HA)과 에볼라 바이러스 당단백질 (GP), 클래스 II Semliki 숲 바이러스 E1 봉투 단백질에 적용할 수 있는 또 다른 이점은 그 다양성에서 온다 단백질, 또는 클래스 III vesicular 구내 염 바이러스 G 당단백질. 방법론의 한계는 그것은 바이러스 항목 단계 조사를 받고 봉투 단백질에 의해 중재를 정리만 수 이다. 다른 바이러스 성 수명 주기 단계를 공부, 다른 방법이 필요 합니다. pseudotype 입자를 사용할 수 있습니다 많은 응용 프로그램의 예로 호스트 셀 민감성 및 차 있는 굴곡 운동 테스트 바이러스 항목 억제제를 사용 하는 바이러스 항목 경로 해 부의 효과 조사.

Introduction

호스트 셀 항목 바이러스 성 전염 성 라이프 사이클의 초기 단계를 구성합니다. 엔벌로프된 바이러스에 대 한 단일 호스트 세포 수용 체 또는 바이러스 성 및 세포 막의 융합에 의해 따라 여러 수용 체에 바인딩을 해야 합니다. 이러한 필수적인 기능 바이러스 성 봉투 glycoproteins1,2에 의해 수행 됩니다. 코로나 바이러스 봉투 당단백질 스파이크 (S) 단백질 이라고 하며 클래스의 멤버인 나 바이러스 성 융해 단백질2,3,4,,56. 바이러스 성 봉투 glycoproteins와 같은 특정된 바이러스의 많은 중요 한 특성을 이해 하기 위한 중요 한입니다: 주기 개시, 그 호스트와 셀룰러 차 있는 굴곡 운동, interspecies 전송, 바이러스 성 병 인으로 호스트 셀 항목 경로입니다. 바이러스 성 pseudotyped 입자, 라고도 함 pseudovirions는 쉽게 바이러스 성 융해 단백질의 기능 연구를 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. Pseudotyped 입자 또는 pseudovirions는 그들의 표면에 분리 바이러스 성 봉투 단백질으로 대리 바이러스 코어의 구성 된 공상 virions. 프로토콜의 주요 목적은 얻을 하는 방법을 보여 코로나 스파이크 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 코어 기반 luciferase 취재 원 유전자를 포함 하는 pseudotyped 입자. 예를 들어 pseudotyped 입자는 높게 병원 성 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)와 중동 호흡기 증후군 (MERS) coronaviruses의 스파이크 단백질을 생산 하는 방법은 제공 됩니다. 프로토콜은 luciferase 분석 결과 여 infectivity 정량화 및 참여, 어떻게 취약 대상 감염 세포, transfection 절차를 설명 합니다.

항목 단계는 pseudovirions의 그들의 표면에 코로나 S에 의해 규율 됩니다, 이후 그들은 입력 셀 비슷한 패션에 네이티브 대응 합니다. 이와 같이, 그들은 기능적인 infectivity 분석 실험의 우수한 대리 모 알선입니다. Pseudotyped 입자는 일반적으로 같은 레트로 바이러스 (MLV7,8,9,10,11,,1213 부모의 모델 바이러스에서 파생 된 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 그리고 lentivirus 인간 면역 결핍 바이러스-HIV23,24,25,26,27,,2829 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) 또는 rhabdoviruses (vesicular 구내 염 바이러스-VSV36,39,40,41,42,,4344 , 45 , 46 , 47). pseudotyping에서 사용 될 때 부모의 바이러스의 게놈 전체 복제 주기를 달성에 결함이 렌더링 필수 유전자를 제거 하 수정 됩니다. 이 중간 biosafety 수준 시설 (BSL-2)에서 사용할 수 있도록 기능과 높은 biosafety 시설 (BSL-3, BSL-4로 쉽게 사용할 수 있는)를 요구 하는 높게 병원 성 기본 바이러스를 사용 하 여 중요 한 장점 때 바이러스 항목 연구를 실시. 여기, 위험의 S 단백질 그룹 3 병원 균 SARS CoV와 메 CoV MLV에 통합 되는 바이러스 성 봉투 단백질의 예제로 사용 됩니다 pseudotyped 입자 사스 CoV S와 메 CoV S pseudovirions 생성 (SARS-Spp와 메-Spp, 각각). 이러한 pseudovirions 이러한 바이러스48,49,,5051의 항목 이벤트에 초점을 맞추고 연구에 성공적으로 사용 되었습니다. 또 다른 장점은 여기에 설명 된 기술을 pseudotyping 코로나 S 단백질에 국한 되지 않습니다: 그것은 매우 유연 하 고 바이러스 성 융해 단백질의 세 클래스의 대표를 통합 하는 데 사용할 수 있습니다. 예로 인플루엔자 조류 (하, 종류 I)52, 에볼라 바이러스 당단백질 (GP 클래스 I), E1 단백질의 alphavirus Semliki 숲 바이러스 (SFV, 클래스 II), 그리고 VSV 당단백질 (G, 클래스 III)53. 또한, 바이러스 성 당단백질의 종류 이상의 인플루엔자의 경우 공동 pseudotyped 입자에 통합 될 수 및 없음-하-pseudotyped 입자51.

Bartosch 외.20에 의해 수행 하는 작업에 따라,이 프로토콜 설명 MLV의 생성 3-플라스 미드 공동 transfection 전략을 널리 사용 하 고 높은 transfection 유능한 HEK 293T를 사용 하 여 pseudotyped 입자 셀 라인 54. 첫 번째 플라스 미드 MLV 핵심 유전자 개 그 및 pol 인코딩하 하지만 MLV 봉투 env 유전자 부족. 두 번째 플라스 미드는 반딧불 luciferase 취재 원 유전자, 함께 5’는 MLV Ψ RNA 포장 신호를 인코딩하는 전송 벡터-3′-측면 MLV 오래 단말기 반복 (LTR) 지역. 3 플라스 미드가 인코딩합니다 관심, 융해 단백질을 경우에 사스 CoV S 또는 메 CoV S 단백질을. Transfection 시 약을 사용 하 여 3 개의 플라스 미드의 공동 transfection 시 바이러스 성 RNA와 단백질 pseudotyped 입자의 생성을 허용 하는 transfected 세포 내에서 표현 얻을. MLV pseudovirion 백본으로 사용, 이후이 원형질 막에서 발생: luciferase 진 기자와 포장 신호를 포함 하는 RNAs 또한 코로나 플라즈마 멤브레인 표현 스파이크를 통합 하는 초기 입자에 캡슐화 얻을 단백질입니다. 셀에서 밖으로 새싹 입자 그들의 표면에 코로나 S 단백질을 포함 하 고 infectivity 분석 실험에서 사용 하기 위해 수확. Pseudotyped 입자 항구 코로나 S 단백질과 하지 MLV 봉투 단백질, 세포 감염을 위해 사용 될 때, 때문에 그들은 그들의 네이티브 코로나 바이러스 대응 항목 단계 처럼 동작 합니다. 바이러스 성 RNA luciferase 기자를 포함 하 고 LTRs 측면은 다음 셀 내에 발표 하 고 retroviral 중 합 효소 활동 활성화 DNA에 그것의 반전 녹음 방송 및 호스트 세포 게놈으로 통합. 감염 된 세포에 바이러스 성 pseudotyped 입자의 infectivity의 정량화 다음 간단한 luciferase 활동 분석 결과 함께 수행 됩니다. 호스트 세포 게놈으로 통합 되 면 DNA 시퀀스 luciferase 유전자와 MLV 또는 코로나 바이러스 단백질 암호화 유전자의 포함, 때문에 그들은 본질적으로 기본 복제 유능한 바이러스 보다 사용 하기 더 안전 하다.

뿐만 아니라 안전한 대리 모 알선 및 높은 봉투 glycoproteins의 다양 한 종류의 수 있도록, 여기에서 설명 하는 pseudotyped 입자는 또한 매우 다양 한 적응력과 바이러스 항목의 여러 측면을 연구 하는 데 사용 될 수. 이 포함 되지만 국한 되지 않습니다: 바이러스 감염 호스트 셀 민감성을 테스트, 엔벌로프된 바이러스를 사용 하 여 셀룰러 항목 경로 분석, 약리 억제제 및 마약 검사의 효과 공부 하 고, 중화 항 체를 실시 분석 실험, 교양 없는 엔벌로프된 바이러스의 호스트 셀 항목 특성화 및 유전자 배달에 대 한 바이러스 성 벡터 생성 관심, 또는 유전자 침묵 시키기의 유전자의 세포질 표정 안정.

Protocol

1입니다. 셀 Pseudotyped 입자 생산에 대 한 시드 참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다. 표준 셀 문화 기술로 얻을 완전 한 Dulbecco에 passaged HEK-293T/17 셀의 80-90% confluent 75 c m2 플라스 크의 수정이 글의 중간 (DMEM-C) 포함 하는 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 IU/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스. Transfections (그것의 구성은 같은 DMEM C 하지만 항생제 없이)에 대 한 T DMEM 매체를 준비 합니다. 10 mL의 사전 예 열된 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS)에 포함 된 셀 두 번 씻는 다.참고: 그들은 쉽게 분리로 주의 HEK293T/17 셀을 처리 합니다. 상쾌한 발음 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 0.25 %trypsin 솔루션의 1 mL로 세포 분리 37 ° C, 5% CO2 배양 기 3−5 분 또는 때까지 분리를 시작 하는 셀에 셀의 플라스 크를 배치 합니다.참고: 잠복기 5 분 이상에 대 한 트립 신으로 셀이 일반적으로 세포 응집을 리드 하지 마십시오. DMEM C 매체 및 count 셀 셀 슬라이드 및 가벼운 현미경을 사용 하 여 4 개 mL를 추가 하 여 트립 신을 비활성화 합니다.참고: 것을 피하기 위해 너무 많은 셀, 추가 희석 단계 미리 필요할 수 있습니다. Trypsinized 셀의 실제 셀 밀도 계산할 때이 희석 요소를 기억 하십시오. DMEM c5 셀/mL 5 x 10을 셀 희석 6 잘 조직 배양 플레이트 잘 당 셀 솔루션의 2 mL와 씨앗 부드럽게 접시를 앞뒤로 이동 하 고 균일 하 게 배포 셀, 원형 모션을 피하고 측면에 사이드.참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 균등 하 게 분산된 셀 셀 우물의 센터에서 덩어리 하지 않습니다 보장 됩니다. 차례 차례로, 이것은 보장 좋은 transfection 효율 및 pseudotyped 입자 생산. 접시 하룻밤 (16-18 h) 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서에서 품 어. 2. 3-플라스 미드 공동 transfection 참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다. 셀 셀 형태 및 밀도 대 한 확인을 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 합니다.참고: 이상적으로, 셀 밀도 40-60 %confluency 범위에 있어야 한다. 그것은 중요 한 세포는 둘 다 너무 합칠 (80−90% 합칠)도 너무 띄엄띄엄 (20−30% 합칠) 각 잘 배포. 40−60 %confluency 셀 밀도 좋은 pseudotyped 입자 생산을 보장 합니다. 플라스 미드 믹스 다음 표 1에 표시 된 6 잘 플레이트 한 우물에 대 한 양의 각 봉투 당단백질의 플라스 미드 믹스를 계산 합니다. 여러 우물을 transfecting 경우 수량을 곱하기 고 혼합 부족 하지 않도록 하는 추가 잘을 포함 합니다.참고: 사스 CoV S와 플라스 미드를 인코딩 메 CoV S, 긍정적인 통제 당단백질 함께 바이러스 성 봉투 glycoproteins (Δenv 입자)와 같은 부족 부정적인 제어 입자의 생성에 대 한 빈 벡터 제어 포함 기공을 구내 염 바이러스 (VSV) G 당단백질 튼튼하게 셀 (VSV Gpp)의 매우 넓은 범위를 감염으로 알려져 있다. 플라스 미드는 요청 시 사용할 수 있습니다. 혼합은 microcentrifuge 튜브에 플라스 미드 및 감소 된 혈 청 세포 배양 매체 ( 재료의 표참조)의 볼륨을 계산 합니다. 지질에 기초를 둔 transfection 시 혼합 ( 재료의 표참조) 한 음 (1:3 transfection 비율, 곱하기 수량 필요에 따라)에 대 한 표 2 에 표시 된 수량에서 transfection 시 믹스에 대 한 볼륨을 계산 합니다. Transfection 시 믹스의 밖으로 실행 되지 않도록 추가 웰 스를 포함 한다. 혼합 계산 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (잘 당 3 µ L) 및 감소 된 혈 청 세포 배양 (잘 당 47 µ L) microcentrifuge 관에서의 볼륨 감소 된 혈 청 세포 배양 매체와 아닌 다른 방법으로 transfection 시 약을 추가 하 주위. 둘 다 믹스를 품 어 (한 우물에 대 한: 50 µ L 플라스 미드의 믹스 및 믹스의 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 50 µ L) 실 온에서 5 분에 대해 별도로. Transfection 시 믹스의 내용을 1:1 비율로 플라스 미드에 추가 (잘 1: 각 혼합의 50 µ L) 철저 한 상하 pipetting 결과 믹스를 수행 합니다. 실내 온도에 적어도 20 분 동안 혼합 품 어. 셀의 보낸된 중간 발음 잘 당 미리 따뜻하게 (37 ° C) 감소 된 혈 청 세포 배양 매체의 부드럽게 1 mL를 추가 합니다. 추가 dropwise 100 µ L 각 잘 transfection 혼합의.참고: 그들은 쉽게 분리로 transfection 믹스 HEK 293T의 웰 스를 추가할 때 주의 운동. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 4-6 h에 대 한 셀을 품 어. 항생제를 포함 하지 않는 미리 따뜻하게 (37 ° C) DMEM T 매체의 당 1 mL을 추가참고: 이것은 중요 한 단계 이다. Transfection 시 약은 세포 침투성을 증가 하 고 항생제에 감도 증가. 좋은 transfection 효율 및 pseudotyped 입자 생산을 보장 하기 위해, 그것은 항생제를 포함 하는 세포 배양 매체를 사용 하지 않도록 하는 것이 중요 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 48 h에 대 한 셀을 품 어. 3. pseudotyped 입자 컬렉션 참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다. 세포 세포 형태학 및 일반 조건에 대 한 확인을 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 합니다. 또한 빛이 되어야 하는 매체의 색상을 체크 핑크/약간 오렌지.참고: 이 중요 한 단계입니다. Transfection는와 관련 된 너무 많은 세포 죽음 또는 중간 색깔 주황색/노란색 (산 성 pH) 설정 되어 있는 경우에,이 일반적으로 낮은 수익률을 감염 pseudotyped 입자에 연결 됩니다. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 supernatants transfected 세포의 전송. 290 x g 세포 파편을 제거 하는 7 분에 튜브 원심 명확히 supernatants 살 균 0.45 μ m 기 공 크기의 필터를 통해 필터링. 작은 볼륨 aliquots를 확인 (예:., 500 µ L 또는 1 mL)의 cryovials pseudotyped 바이러스 솔루션. -80 ° c.에 게참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. Pseudotyped 입자는 몇 달 동안-80 ° C에 안정 하지만 일단 해 동, infectivity 잃게됩니다 그들은 다시 그들을 동결 하지 않도록 4. pseudotyped 입자 감염 감염 되기 쉬운 세포의 참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다. 셀 24-잘 접시의 감염 세포의 시드 표준 셀 문화 기술 80−90% confluent 75 c m2 플라스 크 취약 셀 여: SARS CoV Vero-E6 셀 pseudotyped 입자 (SARS-Spp)와 허 7 셀 메 CoV S pseudotyped 입자 (메 종).참고: 확인 하려면 생산 된 pseudotyped 입자는 전염 성, 신중 하 게 pseudovirion infectivity 분석 실험에 대 한 적절 한 취약 셀 라인을 선택 하는 것이 중요 하다. 가난 하 게 관대 한 셀을 사용 하 여 낮은 infectivity 이어질 것입니다. 미리 데워 진된 (37 ° C) DPBS의 10 mL로 두 번 셀을 씻어. 상쾌한 발음 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 0.25 %trypsin 솔루션의 1 mL로 세포 분리 37 ° C, 5% CO2 배양 기 3−5 분 또는 때까지 분리를 시작 하는 셀에 셀의 플라스 크를 배치 합니다.참고: 이 일반적으로 세포 응집을 리드 5 분 이상 trypsin 셀 잠복기 하지 마십시오. 허-7 셀이이 효과에 특히 민감합니다. DMEM C 매체 및 count 셀 셀 슬라이드 및 가벼운 현미경을 사용 하 여 추가 하 여 트립 신을 비활성화 합니다. DMEM c5 셀/mL 5 x 10을 셀 희석 시드 웰 스 24 잘 잘 당 셀 솔루션의 0.5 mL 접시 부드럽게 접시를 앞뒤로 이동 및 균일 하 게 배포 셀, 원형 모션을 피하고 측면에 측면참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 균등 하 게 분산된 셀 셀 우물의 센터에서 덩어리 하지 않습니다 보장 됩니다. 차례 차례로, 이렇게 하면 좋은 infectivity 분석 실험. 각 pseudotyped 입자 (SARS-Spp, 메 종) 및 상태에 대 한 3 개의 실험적인 복제에 대 한 3 개의 우물을 준비 합니다. 감염 되지 않은 (N.I.), 빈 벡터 Δenv 입자와 VSV Gpp 같은 긍정적인 제어 입자에 대 한 웰 스를 포함 접시 하룻밤 (h 16−18) 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서에서 품 어 Pseudotyped 입자 감염 가벼운 현미경에서 세포를 관찰 하 고 시각적으로 셀 confluent 카펫 인지 확인. 얼음 해 동 pseudotyped 바이러스의 cryovials를가지고. 미리 예 열 (37 ° C) DPBS 0.5 mL로 세 번 세척 세포참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 있지 않은 셀 제대로 감염 일반적으로 가난한 infectivity 판독을 리드 하기 전에 씻어 서 셀의 supernatants 발음 해 동된 pseudotyped 입자 솔루션의 200 µ L로 세포 접종 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 1−2 h에 대 한 셀을 품 어. 미리 데워 진된 (37 ° C) DMEM C 매체의 300 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 72 h에 대 한 셀을 품 어. 5. infectivity Luciferase 분석 결과 판독 하 여 정량화 참고: Biosafety 내각에서 초기 단계를 수행 합니다. 해 동 소 기판 (-80 ℃에서 저장) 및 5 배 luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (-20 ° C에서 저장 된)까지 실내 온도 도달. 멸 균 물 1 x luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼를 희석. 셀 pseudotyped 입자와 감염의 supernatants 발음 각 잘을 100 µ L 1 x luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 로커에 접시를 놓고와 락을 (이 시점에서 앞으로 접시 biosafety 캐비닛 외부 처리 될 수 있습니다) 실 온에서 15 분 동안 품 어. 각 관에서 소 기판의 20 µ L을 추가 하 여 각 잘 microcentrifuge 튜브를 준비 합니다. 루미 노 켭니다. 루시페린 기판의 20 µ L을 포함 하는 1 개의 관에 lysate의 10 µ L를 전송 하 여 한 번에 잘 하나 luciferase 활동 측정을 수행 합니다. 부드럽게 혼합 내용, 하지만 튜브의 벽에 액체를 전치 하지 않도록 튜브를 터치 합니다. 장치에서 튜브를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 루미 노를 사용 하 여 튜브의 발광 값을 측정 합니다. 상대 빛 단위 측정 기록. 단계 5.8-5.12를 반복 하 여 모든 웰 스는 분석 했다.참고: 루미 노 읽고 접시 같은 적절 한 장비와 함께이 프로세스를 자동으로 수행할 수 있습니다. 분석 결과 플레이트 형식 (예:, 96 잘 플레이트 형식) 조절 해야 합니다. 6. 데이터 분석 계산 및 상대 luciferase 단위의 평균 및 표준 편차의 표시 소프트웨어를 플롯 그래프를 사용 하 여 계산 luciferase 분석 결과 측정 평균 및 표준 편차 실험 및 생물의 복제. 막대형 차트 표준 편차로 데이터를 플롯 합니다.참고: 데이터에서 통계 분석을 수행할 때 데이터 집합에 적어도 3 개의 생물 복제를 포함 해야 합니다.

Representative Results

대표 결과 사스 CoV S과 메 CoV S infectivity 분석 실험의 pseudotyped 입자는 그림 1에 나와 있습니다. 예상 했던 대로, 두 그림 1A, 1B, VSV G pseudotyped 제어 입자 (VSV Gpp) 10에 매우 높은 평균 infectivity 준 긍정적인6 107 상대 luciferase 단위 (RLU)에 각각 범위. 사스 CoV s 취약 Vero-E6 셀의 pseudotyped 입자 (그림 1A) 감염, 강한 평균 infectivity 9.8 x 10에 측정 되었다4 RLU. 이 값은 거의 3 배나 감염 되지 않은 컨트롤에 대 한 측정 값 보다 더 높은 (1.1 x 102 RLU), 또는 Δenv 입자 (1.5 x 102 RLU)는 그들의 표면에 어떤 바이러스 성 봉투 glycoproteins 항구 하지 않습니다. 마찬가지로, 메 CoV S에 대 한 허-7 세포의 pseudotyped 입자 (그림 1B) 감염, 높은 평균 infectivity 약 1.0 x 10에 측정 되었다6 RLU. 이것은 거의 4 배나 감염 되지 않은 컨트롤에 대 한 측정 값 보다 더 높은 (0.8 x 102 RLU), 또는 Δenv 입자 (2.0 x 102 RLU). 추가 infectivity 분석 결과는 SARS Spp와 메 Spp 순차적으로 희석 되었고 Vero-E6 셀 (그림 2A)를 감염 하는 데 사용 수행 되었다. 이 분석 결과 측정 luciferase 활동은 세포를 감염 하는 데 사용 하는 입자의 농도에 따라 확인 합니다. 우리가 제대로 허용 HEK 293T 세포를 사용 하는 첨부 파일 및 항목 pseudotyped 입자의 중재에 각각 안 변환 효소 2의 역할 (ACE2) 및 dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), 사스 CoV와 메 CoV의 수용 체를 확인 하 고 ACE2 또는 DPP4 표현할 수 페 (그림 2B). Transfected 세포 infectivity 분석 결과 대 한 다음 사용 되었습니다. 이 분석 ACE2 DPP4의 overexpression, 시는 사스 Spp와 메 Spp infectivity ~ 4 로그와 ~ 2-로그 증가 각각 보여 줍니다 pseudovirions의 그 수용 체 사용을 확인 하는 것은 네이티브 바이러스 비슷합니다. 여기에 표시 된 예는 긍정적인 제어 (VSV Gpp) 조건에 뿐만 아니라 pseudotyped 입자를 생산 하는 경우의 중요성 등 부정적인 (감염 되지 않은 Δenv 입자)를 보여 줍니다. 실제로, 긍정적인 제어 VSV Gpp 입자 수 pseudotyped 입자의 특정 배치 기능과 infective pseudovirions 항복에 성공 여부를 평가. VSV Gpp 입자 선은 106−107 RLU 범위에 대부분 포유류 세포에 의해 일반적인 감염의 결과 예상. HEK-293T/17 프로듀서 셀 (높은 통행 수, 세포 밀도와 문제) 문제 또는 가난한 transfection 효율 전체 pseudotyped 입자 생산과 infectivity 영향을 줄 수. 또한, 부정적인 제어 조건에 또한 중요 한 그들은 우리는 특정 셀 라인 (감염 되지 않은 상태)에서 RLU 측정의 베이스 라인 및 중재 하지 입자 (Δenv 감염)의 일반적인 국제화 평가를 수 의해 바이러스 성 봉투 단백질. 이상적으로, 관심의 바이러스 성 봉투 단백질 입자 pseudotyped의 특정된 유형, 그것 것이 좋습니다 값을 몇 배나 부정적인 컨트롤 값 보다 더 높은 그림 1A, B에서그림과 같이. 그러나, 지정 된 셀 형식에 대 한 pseudotyped 바이러스 감염 매우 작은 infectivity 제공 하는 경우 (즉,, 가까이 부정적인 컨트롤 같은 그림 2B 비 페 N.T. 조건에서) 그것은 반드시 의미 하지 않는다 그는 pseudotyped 입자 생산은 잘못 이었다. 잘 될 수 있는 특정 셀 라인 사용 또는 저조한 아니다 감염을 허용. 여부는 지정 된 셀 형식을 것으로 예상 된다 감염에 감염 될 조사 되 고 바이러스에 의해 확인 하는 것이 좋습니다. 더 효율적인 바이러스 항목 및 ACE2 및 DPP4 수용 체에서의 transfection 시 어디에 표시 된 그림 2B로 발생 하는 감염 바이러스 성 receptor(s) 수를 표현 하는 plasmid(s)와 transfecting 제대로 허용 셀 HEK 293T 대상 셀, ~ 4-와 ~ 2-로그 infectivity, 각각 증가. 플라스 미드/시 약 수량 pCMV-MLVgagpol MLV 개 그와 플라스 미드를 인코딩 폴 300 ng pTG-뤽 전송 벡터 luciferase 기자 400 ng pcDNA-SARS-S, pcDNA-메-S 또는 빈 벡터 300 ng 감소 된 혈 청 세포 배양 매체 50 µ L를 표 1: 플라스 미드 및 감소 된 혈 청의 문화 매체 transfect pseudotyped 입자 생산을 위한 HEK-293T/17 셀의 6 잘 플레이트의 하나 잘 하는 데 필요한 셀. 플라스 미드 준비의 농도에서 플라스 미드 DNA의 필요한 금액을 도달 필요한 볼륨을 계산 합니다. 하나 이상의 잘 동일한 플라스 미드와 페는, 볼륨에 transfect, 우물의 필요한 수를 곱하면 고 추가 잘 혼합 나중 단계에 부족 하지 않도록 하는 계산에 포함. 페 되 고 DNA의 총 금액은 1 µ g/잘. 플라스 미드로 요청 시 사용할 수 있습니다. 시 약 수량 Transfection 시 약 3 Μ L 감소 된 혈 청 세포 배양 매체 47 Μ L 표 2: transfection 시 약 및 감소 된 혈 청의 문화 매체 transfect pseudotyped 입자 생산을 위한 HEK-293T/17 셀의 6 잘 플레이트의 하나 잘 하는 데 필요한 셀. 볼륨 transfect 나중 단계에서 혼합의 밖으로 실행 되지 않도록 계산에 추가 웰 스를 포함 하는 우물의 필요한 수를 곱하면 됩니다. Transfection 시 약: 플라스 미드 DNA 사용 비율은 3:1. 그림 1 : 코로나 S-pseudotyped 입자 infectivity 분석 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 백본 및 luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 취약 호스트 셀에. (A) SARS CoV S pseudotyped 입자 infectivity 분석 결과 Vero-E6 셀에. (B) 메 CoV S pseudotyped 입자 infectivity 분석 결과 허 7 셀에. 모두 (A) (B), 그려진된 데이터에 해당 평균 상대 luciferase 단위, 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차 (사 우 스 다코타)에 해당 하는 오차 막대와 함께. Y 축에 로그10 규모에서 데이터 플롯. N.I.: 비 감염 제어; Δenv: pseudotyped 입자 바이러스 성 봉투 glycoproteins와 VSV Gpp 감염: 감염 베어링 긍정적인 제어 VSV G 봉투 당단백질 pseudotyped 입자. 다른 약어 사용, SARS Spp: SARS CoV s 감염 pseudotyped 입자, 메 종: 메 CoV s 감염 pseudotyped 입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : CoV S-pseudovirion infectivity와 SARS Spp와 메 종 항목에서 ACE2 및 DPP4 수용 체의 역할의 농도 의존. (A) 농도-의존성 SARS Spp와 메 Spp infectivity luciferase 활동 분석 결과 의해 측정의 Pseudovirions 직렬 희석 되었고 Vero-E6 셀을 감염 하는 데 사용. (B) Infectivity SARS Spp와 제대로 허용 HEK 293T 대상 셀에 메-Spp의 분석 결과 표현 ACE2 하 페 및 DPP4 수용 체, 각각. 데이터 표준 편차 (사 우 스 다코타)에 해당 하는 오차 막대와 중복 실험에서 그림 1 과 같이 y 축에 로그10 규모에서 플롯. N.T.: 비 페 제어 HEK 293T 세포; ACE2: 안 변환 효소 2 (SARS CoV 수용 체)와 DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (메 CoV 수용 체). 다른 약어 사용은 그림 1과 같이 동일 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜에는 베어링의 위험 그룹 3 coronaviruses, SARS CoV와 메 CoV BSL-2 설정에서 S 단백질 pseudotyped 입자를 효율적으로 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 입자 luciferase 취재 원 유전자를 통합 하는 비교적 간단한 luciferase 분석 결과48,49,,5051에 의해 코로나 S 중재 항목 이벤트를 쉽게 계량 하 가능 Infectivity 분석 허용 셀을 사용 하 여, 우리는 측정 luciferase 활동 입자의 농도에 따라 달라 집니다 확인 합니다. 또한, ACE2 및 DPP4 수용 체 transfection HEK 293T 세포 등 제대로 허용 셀 라인에서 더 효율적인 항목에 대 한 수 있습니다. 방법과 매우 다른 바이러스 성 봉투 glycoproteins에 적응할 수 있는 광범위 하 게 사용 되었습니다48,49,50,,5152,53, 55,56,,5758,59, 생 화 확 적인 분석 또는 기본 바이러스 감염과 같은 다른 분석을 보완 하기 위해 자주.

우리는 여기에 설명 하는 프로토콜 레트로 바이러스 MLV luciferase 기자 통합을 기반으로 합니다. 그러나, 그것은 매우 다양 한 다른 pseudotyping 시스템을 성공적으로 개발 된 포장 코로나 바이러스에 대 한 S12,13,,2526, 는 강조 하는 것이 중요 30 , 31 , 32 와 다른 바이러스 성 봉투 glycoproteins10,11,14,,1617,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. 이러한 다른 시스템의 일부를 기반으로하는 일반적으로 사용 되 MLV retroviral 코어7,8,,910,11,12,13 ,14,15,,1617,18,19,20, 또는 널리 lentiviral V-1에 따라 다른 전략23,,2425,26,27,28,29,30 사용 하 여 pseudotyping 시스템 ,31,32,33,,3435, 광범위 한 통합을 허용 하는 rhabdovirus vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 코어로, 또는 봉투 glycoproteins, 그리고 다시 다양 한 전략 고용37,38,39,40,,4142,43 ,,4445,,4647. 또한, 형광 단백질 등 다른 기자와 같은 GFP11,13 및 RFP36또는 이외에 β-galactosidase16,17 같은 luciferase 효소 분 비 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP)42 측정을 위한 성공적으로 고용 되어 있다. 또한,이 프로토콜에서 제공 하는 분석 결과에 과도 transfection MLV 및 CoV S 유전자와 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 그러나, 식, pseudotyped 바이러스7,14의 생산에 대 한 안정 된 세포의 생성 등을 위한 다른 전략이 있다. 이러한 시스템의 각 그들의 장점과 단점이 있다, 그것은 어떤 pseudotyping 시스템 최고의 탐정의 요구에 적합 한 결정할 때 다음과 같은 중요 한 매개 변수를 고려 하는 것이 중요: pseudovirion 코어 (MLV, 에이즈-1, VSV 또는 다른 사람), 어떻게 선택적 특정 pseudotyping 코어는 특정 바이러스 성 봉투 당단백질, 분석 결과 판독 (GFP, luciferase, SEAP 또는 다른), 기자와 transfection 전략 (공동 transfection, 과도에 관련 된 플라스 미드의 수 고에 transfection 또는 안정 된 세포의 생성).

방법에 중요 한 단계를 강조 하는 것이 중요 수가 있다. 셀 밀도, HEK-293T/17 프로듀서 셀 라인의 특히 성공적인 transfection 확보에 중요 한 요소 이다. 40-60 %confluency 범위에서 셀 밀도 수 발견 됐다. 높은 밀도 낮은 transfection 효율 및 낮은 입자 생산에서 일반적으로 발생할. 또한, HEK-293T/17 셀은 다른 셀 라인 보다 덜 부착을 염두에 중요 하다. 불필요 하 게 그들을 분리 하는 피하기 위해 그들을 처리할 때 관리를 행사 한다. 하나의 옵션 준수를 향상 시키기 위해 폴 리-D-리 셀 문화 플라스틱 표면 치료 하는 것입니다. 또한, 더 높은 셀 통로 종종 가난한 transfection 비율에 있는 결과. Transfection 시 HEK-293T/17 셀을 추가한 후 그것은 또한 세포 침투성 증가 기억 하는 것이 중요입니다. 이 때문에 시점에서 그들은 세포 독성을 증가 시킬 수 있습니다으로 중간 포함 된 항생제를 사용 하지 않도록 최상 이다. Pseudotyped 입자를 수집 하기 전에 transfected HEK-293T/17 셀 supernatants의 색을 확인 합니다. 일반적으로, transfection의 48 h 후 세포 배양 매체 컬러는 오렌지 핑크 가미를 걸립니다. 노란색 색 매체 일반적으로 가난한 pseudotyped 입자 수율으로 변환 하 고 종종 문제와 셀 밀도 높은 통행 수를 뿌리기의 결과 이다.

이 프로토콜에 pseudotyped 입자 생산 6 잘 플레이트 형식으로 수행 됩니다. 생산된 입자의 볼륨을 증가, 6 잘 플레이트의 여러 우물 같은 플라스 미드 믹스와 함께 페 수 고는 supernatants 함께 풀링된 수 있습니다. 명확히 하 고, 필터링 및 aliquoted에 다음 풀 수 있습니다. 또는 혈관의 다른 종류를 생산 규모 (예를 들어, 25, 또는 75 c m2 플라스 크) 사용할 수 있습니다. 이 경우 transfection 조건 한다 수평 따라. 이 프로토콜에서 infectivity 분석 결과 24-잘 플레이트 형식 및 루미 노만 한 번에 측정 한 관 수를 사용 하 여 수행 됩니다. 높은 처리량 검사에 대 한 다른 포맷 가능, 96-잘 플레이트 형식 및 플레이트 리더 루미 노 등도 있습니다. 볼륨 및 시 약 luciferase 분석 결과 대 한 적절 하 게 적응 시킬 필요가 있다. -80 ° C에서 cryovials에 pseudotyped 입자의 저장 infectivity에서 눈에 띄는 감소 없이 몇 달 동안 그들의 안정성을 유지합니다. 그것은 동결-해 동 주기로이 시간이 지남에 자신의 infectivity 줄어에 그들을 권장 하지 않습니다. 따라서, 그것은 0.5-1 작은 aliquots에 그들을 저장할 좋은 mL 감염 하기 전에 그들을 재개 하 고.

여기에 제시 하는 메서드는 몇 가지 제한이 있습니다. 중요 한 pseudotyped 입자만 바이러스 항목 이벤트를 정리 하는 사실 이다. 전염 성 수명 주기의 다른 단계를 분석, 다른 분석 실험이 필요 합니다. 또한, 플라즈마 막에서 MLV 입자 버드, 그것은에서 중요 한 그 봉투 당단백질을 생산 하는 동안 pseudovirions에 설립에 대 한 원형질 막에도 트래픽을 필요로 공부 되 고 마음. 이와 같이, 그것은 아는 것이 중요 어디 셀에 특정 바이러스 성 봉투 당단백질은 표현 transfection 조건에서와 같은 면역 형광 분석 결과와 subcellular 지 방화를 시각화 및 보존 신호에 대 한 확인 하 여 단백질입니다. 또한, 프로토콜에서는 생산 infectivity 테스트 하는 단계에 설명 합니다, 하지만 pseudotyped 입자에 바이러스 성 봉투 glycoproteins의 결합을 측정 하는 방법을 선발 하지 않습니다. 한 방법은 앞에서 설명한50,51 메 CoV S 통합으로 입자의 집중된 솔루션에 서쪽 오 점 분석 실험을 수행 하는. 이 분석 실험에서 메 CoV의 S 봉투 당단백질 정상화 입자로 S 단백질의 설립을 허용 하는 MLV, capsid (p30) 단백질 함께 조사 이다. Pseudovirions로 바이러스 성 봉투 당단백질 설립 분석 등 분석 실험의 다른 예제는 HIV 1 lentiviral pseudovirion 시스템32 , 다른 MLV pseudotyped에서 에볼라 당단백질 (GP)에서 사스 CoV S 통합 수행 되었습니다. 입자 시스템17, 인플루엔자 조류 (HA) 및 응집 VSV pseudovirions38(없음). Pseudotyped 입자 생산을 특성화에 최근 개발은 Nanosight 같은 혁신적인 이미징 장치 사용: 직접 시각화, 계량, 및 바이러스 성 입자50크기를 수 있습니다. 전반적인 입자 생산;에 자세한 정보를 제공 하는 장치 그러나, 그것은 그것은 봉투 당단백질 설립에 정보를 제공 하지 않습니다 명심 하는 것이 중요입니다. 이 다재 다능 한 pseudovirion 입자의 응용 프로그램에 대 한 미래 방향을 추적 하는 단일 입자, 마이크로 및 총 내부 반사 형광 현미경60,61 사용 하 여 개별 바이러스 퓨전 이벤트를 분석 하는 ,62. 이러한 접근 방식은 성공적으로 인플루엔자 바이러스 및 고양이 코로나 입자 뿐만 아니라 인플루엔자 HA-와 NA-pseudotyped VSV 기반 pseudovirions63에 적용 했다. 코로나 S pseudotyped MLV 기반 입자에 적용 되는 이러한 기술 배포 현재 개발 되고있다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

유용한 코멘트에 대 한 휘 태 커와 다니엘 연구소의 모든 구성원에 게 감사 하 길. NIH에 의해 제공 된 연구 자금 보조금 R21 AI111085 및 R01 AI135270. 고작 인정 코넬 대학 및 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램 부여 번호 아래에서 대통령 생명 과학 원정대 지원 DGE-1650441입니다. L.N. 인정 사무엘 C. 플레밍 가족 대학원 친교 및 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램 부여 번호 아래에서 지원 DGE-1650441입니다. 이 작품은 국립 과학 재단 1504846 (사 우 스 다코타 G.R.W.)를 하 여도 지원 됩니다.

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
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