Site-verwiesene Mutagenese für In Vitro und In Vivo Experimente veranschaulicht mit RNA-Interaktionen in Escherichia Coli
Summary
Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in Desoxyribonukleinsäure (DNA) einzuführen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie die Site-verwiesene Mutagenese mit einem 2-Schritt tun und 3-Stufen-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierenden Ansatz, die auf DNA-Fragment von Interesse anwendbar ist.
Abstract
Site-verwiesene Mutagenese ist eine Technik verwendet, um bestimmte Mutationen in der DNA zu untersuchen, die Interaktion zwischen kleine nicht-kodierende Ribonukleinsäure (sRNA) Moleküle und Ziel-Messenger-RNAs (mRNAs) einzuführen. Darüber hinaus dient die Site-verwiesene Mutagenese spezifischen Proteins Bindestellen RNA zuordnen. Eine 2- und 3-Schritt PCR-basierte Einführung von Mutationen wird beschrieben. Der Ansatz ist für alle Protein-RNA und RNA-RNA Wechselwirkungsstudien relevanten. Kurz gesagt, setzt die Technik auf Primer mit der gewünschten Auge und durch 2 oder 3 Schritte der PCR Synthese ein PCR-Produkt mit der Mutation zu entwerfen. Das PCR-Produkt wird dann zum Klonen verwendet. Hier beschreiben wir, wie auszuführenden Site-verwiesene Mutagenese mit dem 2 – und 3-Schritt-Ansatz einzuführen Mutationen die sRNA, McaS und die mRNA, CsgD, RNA-RNA und RNA-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Wir wenden diese Technik um RNA Interaktionen zu untersuchen; Allerdings ist die Technik für alle Mutagenese Studien (z. B. DNA-Protein Interaktionen, Aminosäure Substitution/löschen/hinzufügen). Es ist möglich, jede Art von Mutation mit Ausnahme von nicht natürlichen Basen einzuführen, aber die Technik ist nur anwendbar, wenn ein PCR-Produkt für nachgeschaltete Anwendung (z. B. Klonen und Vorlage für weitere PCR) verwendet werden kann.
Introduction
DNA wird oft bezeichnet als die Blaupause einer lebenden Zelle da alle Strukturen der Zelle in der Reihenfolge ihrer DNA kodiert werden. Exakte Replikation und DNA-Reparaturmechanismen sicherstellen, dass nur eine sehr geringe Raten von Mutationen auftreten, das ist wichtig für die Erhaltung der richtigen Funktionen kodiert Gene. Veränderungen der DNA-Sequenz können aufeinander folgende Funktionen auf verschiedenen Ebenen, beginnend mit DNA (Anerkennung von Transkriptionsfaktoren und Restriktionsenzyme), dann RNA (Basenpaar Komplementarität und Sekundärstruktur Veränderungen) und/oder Protein (Aminosäuren beeinflussen. saure Substitutionen, Streichungen, Ergänzungen oder Frame-Schichten). Während viele Mutationen Genfunktion nicht erheblich beeinträchtigen, können einige Mutationen in der DNA enorme Auswirkungen haben. Site-verwiesene Mutagenese ist damit ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer DNA-Standorte auf allen Ebenen.
Dieses Protokoll beschreibt einen gezielte Mutagenese-Ansatz verwendet, um bestimmte Mutationen einzuführen. Das Protokoll stützt sich auf zwei verschiedenen PCR-Strategien: eine 2-stufige oder ein 3-Stufen-PCR. Die 2-stufige PCR ist anwendbar, wenn die gewünschte Mutation in der Nähe von 5′-Ende oder der 3′-Ende der DNA von Interesse ist (< 200 Basenpaaren (bp) vom Ende) und die 3-Stufen-PCR ist in allen Fällen anwendbar.
In der 2-Schritt-PCR-Ansatz 3 Grundierungen sind so konzipiert, in denen ein Set der Zündkapseln ist konzipiert, um die DNA des Interesses (Primer 1 und 3, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) verstärken und eine einheitliche Grundierung wurde entwickelt, um die Mutation zu integrieren. Die Mutation, die Einführung der Grundierung (Primer 2) sollte eine umgekehrter Orientierung haben, wenn die Mutation in der Nähe von 5′-Ende und eine nach vorne Ausrichtung, ist wenn die Mutation in der Nähe der 3′-Ende ist. Im ersten Schritt PCR verstärkt Primer 1 + 2 oder 2 + 3 ein kleines Fragment in der Nähe der 5′-Ende oder 3′ Ende, beziehungsweise. Das daraus resultierende PCR-Produkt dient dann als Grundierung in Schritt 2 mit Primer 1 oder 3, wodurch sich ein PCR-Produkt mit einer Mutation in der DNA des Interesses (Abbildung 1A).
In der 3-Stufen-PCR 4 Primer dienen, in denen ein Satz von Primern ausgelegt ist, verstärken die DNA des Interesses (Primer 1 und 4, weiterleiten und rückgängig zu machen, beziehungsweise) und einen Satz von Primern wurde entwickelt, um spezifische Mutationen mit überlappenden Komplementarität zu integrieren (Primer 2 und 3, rückwärts und vorwärts, bzw.). In Schritt eins und zwei, Primer 1 + 2 und 3 + 4 der 5′ und 3′-Ende zu verstärken. In Schritt drei die daraus resultierende PCR-Produkte von Schritt eins und zwei sind als Vorlage verwendet und mit Primer 1 + 4 verstärkt. So ist die resultierende PCR-Produkt die DNA des Interesses mit der gewünschten Mutation (Abbildung 1 b).
Während die mutierte DNA für alle nachgelagerten Anwendungen verwendet werden kann, beschreibt dieses Protokoll die DNA in ein Klonen Vektor neu zu kombinieren. Die Nutzung des Klonens Vektoren hat mehrere Vorteile wie einfache Klonierung und spezifische experimentelle Anwendungen abhängig von den Funktionen des Vektors. Diese Funktion wird oft für RNA-Wechselwirkungsstudien verwendet. Eine andere Technik für RNA-Wechselwirkungsstudien ist strukturelle sondieren der RNA im Komplex mit einem anderen RNA1,2 oder Protein3,4. Jedoch strukturelle sondieren in-vitro-erfolgt erst während Site-verwiesene Mutagenese und anschließende Klonen für Studien zu Wechselwirkungen in vivo ermöglichen.
Site-verwiesene Mutagenese ist beträchtlich für RNA-Wechselwirkungsstudien benutzt worden, wie hier dargestellt. Jedoch die Schlüsselmethode über 2 oder 3-Stufen-PCR gilt für jedes Stück der DNA und somit nicht nur auf RNA-Wechselwirkungsstudien beschränkt.
Um die Technik und ihre Einsatzmöglichkeiten veranschaulichen, dient der Charakterisierung der Regionen wichtig für posttranskriptionale Verordnung der mRNA, CsgD, von Escherichia coli (E. Coli). In E. Coli, CsgD zielt durch die kleine nicht-kodierende RNA, McaS, in Zusammenarbeit mit einem Protein, Hfq, Proteinexpression von CsgD2,4,5zu unterdrücken. Die Technik wird verwendet, um Mutationen der Basis-Paarung Region zwischen CsgD und McaS und der Hfq-Bindungsstelle des CsgDeinzuführen. Die erhaltenen DNA wird dann in einen Vektor geeignet für spätere Experimente geklont. Downstream-Anwendungen der Technik sind in vivo und in-vitro-Experimente. Zur Veranschaulichung Beispiel 1 zeichnet in-vivo mit einem western-Blot-Test und Beispiel 2 in-vitro-mit einem elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) gekennzeichnet ist. In beiden Fällen ist es illustrierte wie Site-verwiesene Mutagenese in Kombination mit anderen Techniken verwendet werden kann, zu biologischen Rückschlüsse auf ein Gen von Interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Site-verwiesene Mutagenese hat eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten, und hier, repräsentative Ergebnisse aus in-vivo und in vitro-Experiment wurden als Beispiele für biologische Schlüsse mit Hilfe der Technik aufgenommen. Site-verwiesene Mutagenese ist seit lange der goldene Standard für RNA-Wechselwirkungsstudien. Die Stärke des Verfahrens liegt in der Kombination der relevanten Mutationen mit nachgeschalteten Tests und Experimenten (z. B. western-Blot oder EMSA) Rückschlüsse auf bestimmte DNA-Website…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten University of Southern Denmark open-Access-Politik Zuschüsse zu danken.
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
