Beoordeling integriteit van de DNA van de cel van de stam voor cardiale celtherapie
Summary
Hier, bieden wij een gedetailleerde beschrijving van een experimentele opstelling voor een analyse van de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen van de stam voorafgaand aan de transplantatie van de cel.
Abstract
Stam en de stam-cel-afgeleide cellen hebben enorme potentieel als een regeneratieve therapie voor verschillende degeneratieve ziekten. DNA is de opslagplaats van genetische gegevens in alle cellen, met inbegrip van stamcellen, en zijn integriteit is fundamenteel voor het regeneratieve vermogen. Stamcellen ondergaan snelle voortplanting in laboratoria te bereiken van de vereiste aantallen voor transplantatie. Versnelde celgroei leidt tot het verlies van DNA integriteit door geaccumuleerde metabolieten, zoals reactieve zuurstof carbonyl en alkylerende agentia. Verplanten van deze cellen zou resulteren in slecht engraftment en regeneratie van het verslechterende orgaan. Bovendien, overplanten DNA-beschadigde cellen leidt tot instabiliteit van het DNA, mutaties, cellulaire senescentie, en eventueel, levensbedreigende ziekten zoals kanker. Daarom is er dringend behoefte aan een methode voor de controle van de kwaliteit te evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie. Hier, bieden wij stapsgewijze protocollen voor de beoordeling van de betrouwbaarheid van de DNA van stamcellen voorafgaand aan de transplantatie van de cel.
Introduction
Experimentele en klinische bewijs toont aan dat cel transplantatie kan matig prestaties linkerventrikel contractiele van falende hart1,2,3,4,5 ,6,,7,,8,9. Recente vooruitgang hebt geopend verder aantrekkelijke mogelijkheden voor cardiovasculaire regeneratie; Deze omvatten de gedwongen uitdrukking van herprogrammering factoren in somatische cellen veroorzaken pluripotent te differentiëren deze geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) in verschillende cardiale lineages, belangrijker cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. het erfelijk materiaal in elke cel, inclusief de kunstmatig geproduceerde iPSCs en de iPSC-afgeleide CM (iPS-CM), is DNA. De genetische instructies worden opgeslagen in DNA dicteert de groei, ontwikkeling en functie van cellen, weefsels, organen en organismen. DNA is niet inert; cel metabolieten, zoals reactieve zuurstof, carbonyl en stikstof soorten, en alkylerende agentia kan oorzaak DNA beschadigen in vitro en in vivo14,15,16,17. Belangrijker, optreedt DNA schade intuïtief in elke cel, met een grote frequentie. Als deze schade worden niet gecorrigeerd, zal dit leiden tot DNA mutatie, cellulaire senescentie, het verlies van DNA en cel integriteit, en eventueel ook ziekten, met inbegrip van levensbedreigende kankers. Behoud van de integriteit van het DNA is daarom essentieel om een willekeurige cel, vooral iPSCs, die heeft een enorm potentieel in de kliniek.
Voor de beoordeling van de hoeveelheid en de integriteit van geïsoleerde genomic DNA, is dure apparatuur beschikbaar op de markt. Er zijn echter geen eenvoudige en kosteneffectieve methoden voor de beoordeling van de integriteit van het DNA in cellen zonder de cellen te isoleren. Gebruiker-geïnduceerde DNA afbraak tijdens DNA-isolatie is bovendien één van de grote nadelen bij het gebruik van deze methoden. De eencellige gel elektroforese (bekend als de komeet assay)18,19 en γH2A.X immunolabeling8 technieken zijn fundamentele benaderingen in onderzoek labs voor de beoordeling van de DNA-beschadiging. Deze twee methoden vereisen geen dure apparatuur of geïsoleerde genomic DNA te analyseren DNA integriteit8,20,21. Aangezien zijn deze technieken uitgevoerd met hele cellen; gebruiker-geïnduceerde DNA/RNA/eiwit-afbraak tijdens de bereiding van de monsters zal niet van invloed op deze protocollen. Hier, om te beoordelen van de schade van DNA en DNA schade reactie in de stam en de stam-cel-afgeleide cellen, bieden wij stapsgewijze protocollen voor het uitvoeren van zowel de komeet-assay en γH2A.X de immunolabeling. Bovendien, het combineren van deze twee benaderingen, stellen wij voor een naïeve beoordeling die kan worden gebruikt voor het evalueren van de cel geschiktheid voor transplantatie.
De komeet assay, of eencellige gel elektroforese, meet de einden van het DNA in cellen. Cellen die zijn ingesloten in lage-smelten agarose zijn lysed naar formulier nucleoids met supercoiled DNA. Bij elektroforese migreren kleine stukjes van gefragmenteerde DNA en gebroken DNA-strengen door de agarose poriën, overwegende dat het intact DNA, vanwege hun enorme omvang en hun vervoeging met de matrix eiwitten, zal een beperkte migratie hebben. Het patroon van gebeitst DNA onder een fluorescentie Microscoop bootst een komeet. Het hoofd van de komeet bevat intact DNA en de staart is samengesteld uit fragmenten en gebroken DNA-strengen. De Fractie van de schade van DNA kan worden gemeten door de intensiteit van de fluorescentie van de beschadigde DNA (de staart van de komeet) ten opzichte van de intact DNA (komeet hoofd) intensiteit. De parameter staart moment kan worden berekend zoals aangegeven in Figuur 1.
DNA-beschadigingen induceert de fosforylatie van Histon H2A. X (γH2A.X) op Ser139 door ATM, ATR en DNA-PK kinases. De fosforylatie en rekrutering van H2A. X op DNA strand einden heet DNA schade reactie (DDR) en gebeurt snel nadat DNA is beschadigd. Na dit proces, celcyclus checkpoint-gemedieerde arrestatie en DNA reparatie processen in gang zijn gezet. Na de succesvolle voltooiing van DNA-herstel, is γH2A.X gedefosforyleerd en geïnactiveerd door fosfatasen genaamd. Verlengd en meerdere DNA strand einden leiden tot de opeenstapeling van γH2A.X foci in DNA. Hiermee wordt aangegeven van de cel onvermogen om te herstellen van de DNA-beschadiging en het verlies van DNA integriteit. Deze γH2A.X foci in DNA kunnen worden geïdentificeerd door en het aantal DDR foci kan worden geteld met behulp van het protocol in sectie 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA integriteit portretteert cel integriteit. Cellen met beschadigde DNA zijn vaak in spanning en uiteindelijk verliezen hun integriteit. De integriteit van de stam en de stam-cel-afgeleide cellen die worden doorgegeven ten behoeve van de transplantatie is het belangrijkste voor de cellen om hun gewenste functie te vervullen. Verplanten van cellen met beschadigde DNA zou resulteren in een slechte engraftment snelheid en prestaties van de cel8,20. Daarom is onderz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Heart, Lung en bloed Instituut subsidies RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 en UO1-HL-134764 (met J. Zhang) en door de American Heart Association wetenschappelijke ontwikkeling Grant 17SDG33670677 (met R. Kannappan).
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
References
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Tomita, Y., et al. Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).
- Oyama, T., et al. Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo. Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).
- Fischer, K. M., et al. Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase. Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).
- Cottage, C. T., et al. Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase. Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).
- Angert, D., et al. Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells. Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).
- Kannappan, R., et al. p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo. EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).
- Hatzistergos, K. E., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).
- Okita, K., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).
- Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).
- Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals. Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).
- Martinez, G. R., et al. Oxidative and alkylating damage in DNA. Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).
- Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).
- Wiseman, H., Halliwell, B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
- Goichberg, P., et al. Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells. Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).
- Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).
- Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).
- Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions. Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state. Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).
