Aislamiento de los tejidos embrionarios y formación de órganos quiméricas pollo codorniz utilizando el ejemplo de timo
Summary
Este artículo proporciona un método para aislar puros tejidos embrionarios de embriones de codorniz y pollo que pueden combinarse para formar ex vivo quimérica órganos.
Abstract
La capacidad de aislar los tejidos embrionarios fue un paso esencial para establecer el sistema de pollo de codorniz quimera, que a su vez ha proporcionado contribuciones indiscutibles a develar procesos clave en la biología del desarrollo.
Es en este documento se describe un método optimizado para aislar los tejidos embrionarios de codornices y pollos por microcirugía y digestión enzimática conservando sus propiedades biológicas. Después de aislamiento, los tejidos de ambas especies se asocian en un ensayo in vitro organotypic de 48 h. de codorniz y los tejidos de pollo pueden ser discriminados por las características nucleares distintas y marcadores moleculares, lo que permite el estudio de la diafonía celular entre heteroespecíficas Asociación de tejidos. Este enfoque es, por lo tanto, una herramienta útil para el estudio de las interacciones de tejido complejo en procesos de desarrollo con modificaciones espaciales altamente dinámicas, tales como ésos que ocurren durante la morfogénesis faríngea y la formación del foregut órganos derivados del endodermo. Este enfoque experimental primero fue desarrollado para estudiar las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación del timo. En este sentido, el rudimento tímico potencial derivados del endodermo y mesodermo derivado mesenchyme, fueron aislados de embriones de codorniz y de pollo, respectivamente.
La capacidad de los tejidos asociados para generar órganos puede probarse más por injerto sobre la membranas corioalantoideas (CAM) de un embrión de pollo. El CAM proporciona nutrientes y permite intercambios de gases a los tejidos explanted. Después de 10 días de desarrollo de ovo, los órganos quiméricos pueden ser analizados en los explantes cosechados por los métodos morfológicos convencionales. Este procedimiento también permite estudiar las contribuciones específicas de tejido durante la formación de órganos, desde su desarrollo inicial (desarrollo in vitro) la fase final de la organogénesis (en desarrollo de ovo).
Por último, el método de aislamiento mejorado también proporciona tridimensionalmente (3D) conserva los tejidos embrionarios, que también pueden utilizarse para el análisis topográfico de alta resolución de los patrones de expresión génica específica de tejido.
Introduction
En la década de 1970, un sistema elegante de codorniz-gallina de quimera fue desarrollado por Le Douarin, abriendo nuevas vías para entender el papel de la migración celular y las interacciones celulares durante el desarrollo1,2. El modelo fue ideado en la premisa de que del intercambio entre las dos especies no molestaría considerablemente embriogénesis, confirmado más adelante cuando se utiliza para el estudio de numerosos procesos de desarrollo, incluyendo la formación de nervioso y las hematopoyéticas sistemas1. Tomando este último como un ejemplo, las ondas cíclicas de progenitores hematopoyéticos colonizando el rudimento epitelial tímica se observó por primera vez utilizando el sistema quimera de codorniz-gallina de3. Para ello, el territorio prospectivo del timo, el endodermo de las bolsas de tercer y cuarto faríngeos (3/4PP), era mecánica y enzimáticamente aislado de embriones de codorniz (q) en 15 – 30 etapa somite [día embrionario (E) 1.5-E2.5]. Estas etapas corresponden a pollo Hamburger y Hamilton4 (HH) – 12-17. Los procedimientos de aislamiento comenzaron con el uso de la tripsina enzimáticamente disociar el endodermo de la mesénquima adjunto. El endodermo aislado se injertó en la región de la somatopleura de un embrión de pollo (c) de host en el E3-E3.5 (HH-etapas 20-21). Este mesénquima heteróloga consideró “permisivo” para el desarrollo de epitelio tímico, contribuyendo también a la formación de órganos3. Después, sucesivas oleadas de las células del progenitor transmitidas por la sangre del huésped pollo se infiltraron en la codorniz donantes tímicas epiteliales contraparte contribuyendo a la formación del timo en el embrión huésped del3.
Más recientemente, una versión modificada de este método fue demostrada para ser importante para el estudio de las interacciones epitelio-mesénquima durante las primeras etapas de formación de timo5. En este sentido, los tejidos involucrados en la formación del timo ectópico en embriones quiméricos3 fueron aislados de embriones de donante y huésped y asociados ex vivo. Se utilizó un protocolo mejorado para aislar el endodermo 3/4PP de codorniz (E2.5-E3) y el mesodermo de la somatopleura de pollo (E2.5-E3). Brevemente, los tejidos embrionarios se aislaron por microcirugía y digestión in vitro pancreatina. Además, las condiciones de digestión enzimática, temperatura y tiempo de incubación fueron optimizadas según el tipo de tejido y etapa de desarrollo (tabla 1).
A continuación, los tejidos aislados se asociaron en un organotypic sistema vitro durante 48 h, como previamente divulgados5,6. La Asociación in vitro de tejidos imita las interacciones locales de celulares en el embrión, superando algunas limitaciones de la manipulación en vivo. Este sistema es particularmente útil para el estudio de las interacciones celulares en complejos eventos morfogénicos, como el desarrollo del aparato faríngeo.
La contribución de cada tejido en la histogénesis del timo, así como la capacidad de la Asociación heteroespecíficas para generar un timo puede ser más explorado utilizando la metodología de CAM, anteriormente detallada5,7,8. Sucintamente, los tejidos cultivados fueron injertados en la leva de embriones cE8 y permitió desarrollar en ovo por 10 días. Entonces, formación de timo fue evaluada mediante análisis morfológico de los explantes cosechados. Como en la clásica de codorniz-gallina de estudios3, el epitelio tímico de codorniz fue colonizado por las células progenitoras hematopoyéticas (HPCs) derivadas del embrión de pollo, que fue demostrado más adelante para contribuir al desarrollo de órgano9,10 . Los HPCs emigraron del embrión a timo ectópico quimérico a la altamente vascularizado CAM5,7,8. Codorniz derivada epitelio tímico puede identificarse por immunohistochemistry usando los anticuerpos específicos para cada especie (es decir, QCPN – MAb codorniz PeriNuclear), superación de la necesidad de marcadores moleculares específicos de tejido.
Este método experimental, como el enfoque de dos pasos registrado en la anterior publicación8, permite la modulación de vías de señalización por la regular administración de agentes farmacológicos in vitro y en el desarrollo de ovo. También, los explantes se pueden cosechar en cualquier momento del curso del experimento8.
Por último, el protocolo de aislamiento aquí detallado permite la preservación de las propiedades naturales y 3D-arquitectura de los tejidos embrionarios, particularmente útiles para detallar patrones de expresión génica en situ de territorios embrionarios de lo contrario inaccesibles por métodos convencionales. Además, enfoques de análisis del transcriptoma, incluyendo RNA-seq o microarrays, pueden también aplicarse en tejidos aislados sin necesidad de marcadores genéticos mientras que proporciona un análisis de alto rendimiento de tejidos específicos “ómicas”.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento de aislamiento de tejido embrionario detallado aquí fue mejorado de las técnicas anteriores para producir embriones quiméricos pollo codorniz en contextos biológicos3,5,6.
Este enfoque es adecuado para aislar los tejidos embrionarios puros sin necesidad de manipulación genética o el uso de marcadores específicos de tejido, que son a menudo indeterminado, limitar el uso de model…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecemos a Isabel Alcobia por la lectura crítica del manuscrito, Mário Henriques video narración y Vitor Proa desde el servicio de histología del Instituto de Histologia e Biologia Desenvolvimento, Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para el soporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro y Hugo Silva de la unidad de audiovisuales (equipo Audiovisual), Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa por su compromiso excepcional con la producción de este video. Reconocemos Leica Microsystems para proporcionar amablemente un estereoscopio equipado con un sistema de vídeo y Interaves – Sociedade Agro-pecuaria, S.A. para contribuir con codorniz huevos fertilizados. Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Metal grid | Goodfellows | fine meshed stainless steel grid | |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30 mm pyrex bowls (Small size) | from supermarket | ||
| 100 x 50 mm pyrex bowls (Large size) | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | Normax | 5426015 | |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm Stainless steel pin |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm Stainless steel microscalpel |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm Stainless steel microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Nickel plated pin holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| NanoZoomer S360 Digital slide scanner | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 |
References
- Le Douarin, N. The Nogent Institute–50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. 발생학. 361 (2), 208-219 (2012).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio–mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Figueiredo, M., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. 발생학. 418 (2), 268-282 (2016).
- Figueiredo, M., Neves, H. Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link. Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).
- Nehls, M., et al. Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium. Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).
- Morahan, G., et al. The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., et al. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. 발생학. 293 (2), 499-513 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).
- Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling. Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).
