与腺相关病毒的向量的生产、纯化和质量控制

解决 方案 组成 细胞培养和转染 dmem1 dmem 1x 1% fbs (v) 1% 谷胱甘肽 (v/v) dem10 dmem 1x 10% fbs (v) 1% 谷胱甘肽 (v/v) 150 mm 氯化钙 4.380 g 氯化钠 高达500毫升超纯水 aav 净化和脱盐 5 m 氯化钠 146.1 g 氯化钠 高达500毫升超纯水 1 m tris hcl (ph 值 8.5) 12.11 g tris base 谨慎 高达100毫升超纯水 使用巴斯德移液器添加 1m hcl, 将 ph 值降低到8。5 裂解缓冲器 15毫升 5 m 氯化钠 25毫升 1 m tris hcl (ph 8.5) 谨慎 高达500毫升超纯水 10倍磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 80克氯化钠 2克 kcl 谨慎 14.4 gna 2hpo4 2.4 g kh 2po4 高达1升dd的水 1 m mgcl2 20.33 g mgcl2-6h2o 高达100毫升超纯水 1 m kcl 7.45 克 kcl 谨慎 高达100毫升超纯水 5倍 pbs 镁钾 (pbs-mk) 库存解决方案 250毫升 10倍 pbs 2.5 毫升 1 m mgcl2 6.25 毫升 1 m kcl 谨慎 高达500毫升超纯水 h2o 15% 碘沙诺 12.5 毫升 optiprep 密度梯度介质 谨慎 5 m 氯化钠10毫升 5毫升5毫升 pbs-mk 17.5 毫升超纯水 25% 碘沙诺 运算浓度密度梯度介质20.8 毫升 谨慎 5毫升5毫升 pbs-mk 19.2 毫升超纯水 100μl 的苯酚红 40% 碘沙诺 33.3 ml 的 optiprep 密度梯度介质 谨慎 5毫升5毫升 pbs-mk 6.7 毫升超纯水 60% 碘沙诺 50毫升的 optiprep 密度梯度介质 谨慎 100μl 的苯酚红 谨慎 aav 纯度控制 10 x 醋酸特利泰酯 (tea) 缓冲器 44.8 g tris base 谨慎 11.4 毫升冰醋酸 (17.4 m) 3.7 g edta 高达1升超纯水 琼脂糖凝胶 0.8 克超纯琼脂糖 高达100毫升 1x tea 缓冲器 凝胶缓冲器 181.7 g tris 基地 谨慎 1.5 克 sds 谨慎 使用 1m hcl 将 ph 值调整为8.45 谨慎 高达500毫升超纯水 阴极缓冲器10倍 121.14 g tris base 谨慎 179.2 g tricine 谨慎 1% sds (w/w) 谨慎 高达1升超纯水 阳极缓冲液10倍 242.3 g tris base 谨慎 高达1升超纯水 使用 1m hcl 将 ph 值调整为8。9 谨慎 样品缓冲器5倍 20毫升: 605毫克 tris 碱 谨慎 4克 sds 谨慎 10毫克伺服蓝 g 12克甘油 将 ph 值调整为 6.8, 使用 1 m hcl, 脂肪, 并存储在-20°c 谨慎 堆叠凝胶 对于2凝胶: 400μl 丙烯酰丙烯酰胺 谨慎 750μl 凝胶缓冲液 1.85 毫升超纯水 4μl temed 谨慎 20μl 10% aps (v/v) 谨慎 在浇注凝胶之前, 立即加入 temed 和 10% aps。在化学引擎盖下使用这两种化学品。 解析凝胶 对于2凝胶: 3.32 毫升丙烯酰胺 谨慎 3.35 毫升凝胶缓冲液 1.14 ml 超纯水 2.12 毫升50% 甘油 6μl temed 谨慎 50μl 10% aps (w/v) 谨慎 在浇注凝胶之前, 立即加入 temed 和 10% aps。在化学引擎盖下使用这两种化学品。 水饱和丁醇 10毫升正丁醇 谨慎 1毫升超纯水 注意事项:有关危险化学品使用的准则, 请参阅材料表。 表 1: 所需解决办法的构成。 1. hek293t 细胞的三转染 请注意:有关协议中使用的缓冲区和解决方案的组成, 请参阅表 1 。请注意:此协议部分的性能大约需要4天。 在37°c 的水浴中解冻一小瓶人胚胎肾 (hek) 293t 细胞。请注意:仅使用经过20x 以下的细胞, 以确保最佳转染效率。 种子 hek293t 细胞的密度为 2 x 10 3 至 6 3 3 细胞在 dem10 在 15 厘米直径的细胞培养皿中. 在37°c 的标准孵化器中, 将细胞生长到70-80% 的融合, 湿度为 95%, co2为5%。请注意:使用该协议生产一批 aav 载体需要18个细胞培养盘 (直径15厘米)。70%-80% 的细胞融合对应于 6 x 10 3 至 7 x10 3 cellscm 2, 保持在 dmem10 培养基的 17-20 ml 中. 以浓度比例为 1/3.5 (w/w) 的方式制备聚乙二醇胺/dna 混合物。 在一个50毫升的锥形管中, 通过在 150 mL 氯化钠的18毫升中混合360微米的 f6、180微克的 pcapsid 和180微米的 p胎外基因, 为18个细胞培养皿准备 dna 混合物。 分布在三个50毫升锥形管 (每个锥形管6毫升的 dna 混合物) 上的 dna 混合物。 通过将840微克的 pei (1μμl) 混合在150毫升氯化钠的6毫升中, 在新的50毫升锥形管中制备6个细胞培养皿。 在含有 dna 混合物的锥形管 (1.4.2 准备) 中加入6毫升的 pei 混合物 (1.4.3 步骤制备), 并在室温下孵育20分钟。请注意:孵育20分钟后, pei只能混合 dna 变得稍微浑浊。 从孵化器中取出6个细胞培养皿, 在层流罩中从每个培养皿中完全吸出培养基。用5毫升预热的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (dpbs) 冲洗菜肴, 去除培养基的痕迹。 通过轻轻倾斜盘面, 确保 dpbs 在整个表面的分布。 轻轻吸气 dpbs, 并在每道菜中添加12毫升的 dmem1。请注意:避免通过慢慢添加培养基来分离细胞, 从放置在盘子边缘的移液器中分离。 通过向上和向下移液 3x-5倍来混合 pei只能脱氧核糖核酸。以逐滴的方式将 pei\ dna 混合物添加2毫升, 并将其精心分布在整个表面。一旦混合添加到每道菜, 把菜放回孵化器。对剩余的文化菜肴重复步骤 1.4.3 1.8。 在37°c 下将转染细胞培养 5小时, 湿度为 95%, co 2 为 5%. 在每个培养皿中添加额外的12毫升 dem10, 而不去除预先存在的培养基 (总介质体积 = 25 毫升)。 在37°c 下, 以95% 的湿度和5% 的 co2 对转染细胞进行移植, 转染后可达 72小时. 补充图 1:hek 293t 细胞形态学可视化的相位对比显微镜 (左) 与确认 gfp 表达可视化的荧光成像 (右).(a) 荧光成像证实了使用 transfection 编码 pTransgene 成功转染 hek293t 细胞。(b) 仅用转染试剂治疗的 hek293t 细胞没有 transfection 表达。请点击这里查看此图的较大版本. 转染后72小时收获培养基和细胞。使用细胞刮刀小心地将细胞从培养皿中分离。收集介质和细胞在一个50毫升锥形管保存在冰上。请注意:两个细胞培养皿的内容可以收集成一个50毫升的锥形管。在这一步结束时, 九管中的每一个都将含有大约50毫升的介质。 在4°c 条件下, 以 420 x g的速度离心锥形管 10分钟, 离心机的加速和减速设置为最大值。 小心地丢弃每个管中的上清液。不要使用移液器来防止材料的丢失。相反, 轻轻地将上清液倒进废物处理容器中, 并将含有细胞颗粒的管道放回冰面上。 通过上下移液 5–10x, 将裂解缓冲液2毫升中的每个细胞颗粒直接重新用于 50 ml 锥形管中。不要漩涡。将三管中的裂解物集中在一起。请注意:此时, 将有三个50毫升锥形管, 每个锥形管含有6毫升的再悬浮细胞在裂解缓冲液中。 2. aav 矢量纯化 请注意:此协议部分的性能大约需要1天。在包含重新悬浮在裂解缓冲液中的细胞的三个 50 ml 锥形管中的每一个上同时执行以下步骤 (见上一注)。 冻结和解冻重新悬浮的细胞 3倍, 使其裂解并释放 aav 粒子。将管子放入装有与乙醇混合的干冰的桶中, 以完成冻结步骤。立即将细胞放置在37°c 的水浴中, 进行解冻。 第三解冻步骤后, 离心机在 1, 167 x g 下 , 在4°c 下15分钟。请注意:将形成一个由细胞碎片组成的明显的颗粒。在处理管道时, 避免突然移动, 因为这些可能会导致颗粒脱离上清液, 这将损害最终矢量的纯度。 小心地转移上清剂清洁50毫升锥形管, 然后在每个管中添加核酸酶, 最终浓度为 50 u/ml 上清液。 在37°c 下孵化30分钟。每10分钟用手旋转50毫升锥形管, 以确保核酸酶与上清液完全混合。 在4°c 下, 以 13 490 x g离心 20分钟, 澄清上清液。 将0.45μm 过滤器连接到 10 ml 注射器上, 并将其放置在干净的 50 ml 锥形管的顶部。小心地取出柱塞, 用2.5 步中的上清液填充注射器。 使用柱塞迫使裂解液通过过滤器。对于在步骤2.5 中获得的每个管的上清液, 使用新的过滤器和注射器。请注意:得到的分数被称为 “粗裂解物”。 根据表 1中的说明, 在四个独立的 50 ml 锥形管中分别制备15%、25%、40% 和60% 的碘氧醇馏分。 使用以下顺序在三个超离心管中制备碘沙诺梯度: 8% 的碘沙诺 15%, 5.5% 碘沙诺的 5.5 ml, 40% 碘沙诺的5毫升, 60% 碘沙诺的 4.5 ml。注意事项:碘沙诺会对眼睛、皮肤、胃肠道和呼吸道造成刺激。在处理碘化醇梯度时, 请戴上手套, 在层流罩下工作。 将15% 碘沙诺的移液器8毫升放入每个超离心管中。 将25% 碘沙诺溶液的移液器 5.5 ml 放入干净的 50 ml 锥形管中 (图 1a)。 使用非分级巴斯德移液器 (因为超离心管的颈部对于传统的分级移液器来说太窄), 小心地将25% 碘沙诺溶液的 5.5 ml 分层在15% 碘沙诺溶液之下 (图 1 b)。请注意:这可以通过在三个步骤中添加碘沙诺来成功实现, 因为巴斯德移液器只能容纳约2毫升。 按照步骤2.9.3 中的说明, 添加40% 和60% 的碘醇溶液。在分层过程中, 不要干扰不同的碘沙诺接口。请注意:由于碘沙诺馏分中添加了苯酚红色, 通过视觉确认可以确保不同碘氧醇组分的正确制备 (见表 1中的说明)。由于每个分数都有特定的密度, 因此, 如果执行得当, 它们在分层步骤中不会混合 (请检查图 1c)。 用巴斯德移液器将粗裂解液分层在15% 碘沙诺梯度的顶部。继续滴落, 以避免干扰粗裂解液和碘沙诺溶液之间的界面。 用裂解缓冲液将超离心管填充, 直到半月板到达管颈底部, 以确保管不会在超离心过程中产生的非常高的力下塌陷 (图 1c)。 使用适当的盖子关闭超离心管。使用数字刻度, 以确保所有三个超离心管具有相同的重量。如有必要, 通过在 “粗裂解液” 上添加更多的裂解缓冲液来调整重量。请注意:超离心管之间的重量差必须低于 0.1 g, 以确保超离心管的安全运行。超离心机是潜在的危险设备, 只能由受过适当训练的人员使用。 在 301,580 x 克的温度下离心管, 使用固定角度的钛转子, 在12°c 下使用最大加速和减速速度1小时和40分钟。 在40% 和60% 的碘醇界面上小心地插入不锈钢钝针。 将针头连接到5毫升注射器上 (图 1e)。 只吸收透明的分数, 包含矢量粒子。请注意:收集的总量约为2.5-3 毫升。避免从25–40% 的界面收集材料, 因为这将增加最终矢量批次中的污染水平, 因为存在不受欢迎的蛋白质。 处理收集的分数 (脱盐和浓缩) 或在4°c 下过夜。 图 1: 碘沙诺梯度纯化和后续载体采集的设置.(a) 在将不同的碘沙诺梯度移入超离心管之前, 将每个碘沙诺溶液的适当体积移入一个单独的锥形管。(b) 然后使用巴斯德移液器依次将每个碘沙诺溶液转移到超离心管: 应在上一层下面的管底部添加越来越高的碘沙诺浓度层。(c) 在准备梯度后, 将粗矢量裂解液分层在顶部。这种矢量收集系统不使用锋利的针头, 这就有可能造成 “针头” 的伤害。(d) 通过碘醇梯度插入不锈钢316注射器针, 直至 40%/60% 的碘醇接口。(e) 在40% 碘醇相中发现了载体颗粒, 并收集了。请点击这里查看此图的较大版本. 3. aav 矢量的脱盐和浓缩 请注意:该协议的这一部分的性能大约需要2小时。 通过在 4, 000 x g 处加入 1x pbs-mk 的5毫升和离心机, 使离心过滤器的滤膜优先, 时间为5分钟。 在采集到的 aav 矢量分数中加入5毫升的 1x pbs-mk, 混合后将总体积加入到滤波器中。在添加 1x pbs-mk 后, 观察到浊度。离心机为 4, 000 x 克, 直到锥形过滤器上的体积已减少到1毫升。丢弃在外收集管中积累的流经。 在锥形过滤器中加入13毫升的 1x pbs-mk, 并根据需要重复离心步骤 (最少 3倍), 直到添加新鲜的 1x pbs-mk 时不再观察到浊度。 在最后清洗步骤中, 以 4, 000 x g 的速度添加13毫升的 pbs + 0.01% (v/v) 非离子表面活性剂和离心机, 直到体积减少到300–350μl。 通过将整个体积移入无菌的微离心管, 收集过滤器上的剩余部分。请注意:该分数包含脱盐浓缩的 aav 矢量。在此协议的以下步骤中, 此分数称为 “主要” 分数。确保将管在引擎盖下, 并将其存放在4°c。 用 1x pbs-mk 的200μl 冲洗过滤器, 以收集留在过滤器上的残余矢量粒子。收集在无菌的微离心管中。请注意:这是一个稀释的矢量股票, 这可能适用于一些需要较低的矢量滴度的应用。在将来的步骤中, 此分数称为 “次要” 分数。 对于短期存储, 将矢量分数存储在 4°c (少于 2周)。当需要长期存储时, 请将矢量储存在-20°c。 按照第4节的说明执行质量控制。 4. 定量聚合酶链反应对载体的滴定 请注意:该协议的这一部分的性能大约需要3小时。 标准曲线 第1节用于 hek-293t 细胞转染的转基因表达质粒 (psrgene) 进行线性化处理。 在 0.5 ml 微离心管中制备限制性消化混合物 (有关限制摘要的组成, 请参阅表 2 )。请注意:根据所使用的酶和制造商的相关指导原则, 调整限制性消化组合的成分。 在37°c 下培养限制消化组合1小时。 在 100v 100 v 的琼脂糖凝胶上运行, 以1小时的速度运行限制性质粒, 以检查限制性质粒的消化效率, 质粒的完全消化应产生一个定义大小的片段。 按照制造商的说明 24, 使用 pcr 纯化试剂盒纯化线性质粒 dna, 并通过测量260纳米的吸收量, 使用分光光度计测量 dna 浓度.滴定后, 将线性质粒的剩余精华储存在-20°c, 以供进一步使用。 计算每微升质粒库存的分子 (即 dna 拷贝), 如下所示。 首先, 计算质粒的分子量。假设 dna 碱基对 (bp) 的平均重量为 650 dalton (da), 而 bp 的一个摩尔重达650克, 则可以通过提取其长度 (bp) 和每个碱基对重量的乘积来估计任何双链 dna 模板的分子量。质粒分子量 [g/mol] = 质粒大小 [bp] x 650 [da/bp] 接下来, 计算每微升质粒的摩尔数。每微升质粒的摩尔 = 质粒浓度 [gμ-l]/质粒分子量 [g/mol]请注意:分子量的反比是在1克的物质中存在质粒的摩尔数。 然后, 使用 avogadro 的数量 (6.022 x10分子摩尔) 计算每微升的质粒分子数。每微升质粒的分子 = 每微公升质粒的摩尔 [摩尔/μl] x avogadro 的数量 [分子/摩尔] 最后, 稀释质粒库存 (分子), 以获得100μl 溶液, 所需浓度为 1 x 109 分子(每微的矢量基因组 (vg))。质粒库存 (100μl) = (所需浓度 [分子/-l] x 100μl)/质粒分子 [分子 使质粒库存 (1 x10 9 vg/μl) 的连续稀释为三重奏:10μl 的 1 x 10 vg/l 质粒库存 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 8 vg/μl 溶液10μl 的 1 x 10 8 vg/l 稀释 + 90μl 的 h 2 o= 1 x 10 7 vg/μl 溶液10μl 的 1 x 10 7 vg/l 稀释 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 6 vg/μl 溶液10μl 的 1 x10 6 vg/l 稀释 + 90μl 的 h2 o= 1 x 10 5 vg/μl 溶液 继续获得 1×101 vg/l 溶液。 将标准质粒库存的连续稀释保持在冰上, 直到将其加载到 qpcr 板上 (第4.3 节)。 组件 量 10倍限制性酶缓冲液 5μl 限制性酶 2, 5μl 质 粒 5微克 h2o 高达50μl 表 2: 限制性摘要混合组合物。 表 3: 库存质粒体积计算器.请点击此处下载此表格. 从 aav 载体中提取 dna 将 aav 载体 (步骤3.5 的主要部分) 与198μl 的 dnase i 缓冲液 (1x) 混合在带材管 (pcr 管) 中, 并添加2μl 的 dnase i。请注意:dnase i 将降解任何不包含在载体 c装载 d 中的遗传物质 (这将扭曲 qpcr 结果)。这种溶液被称为稀释 ‘假 1 x 10 – 2’ 。 在37°c 下孵化 30分钟, 95°c 时再生10分钟。请注意:该协议可以在这一点上停止, 材料可以无限期地存储在 4°c, 以避免产品变质。 在假 1 x 10 – 2 溶液 ( 步骤 4 . 2 . 1 ) 中加入2μl蛋白酶 k , 在50°c孵育 60 分钟 , 在95°c孵育 20 分钟。请注意:此步骤将分解 aav 载体封盖, 并将 aav 矢量基因组释放到溶液中。添加过量的蛋白酶 k, 因为样品中的蛋白质 (衣壳) 含量尚不清楚。请注意, 必须确保在 qpcr 之前通过变性去除所有蛋白酶 k 活性, 以避免 (部分) 聚合物酶降解影响最终结果的问题。 在 1.5 ml 微离心管中制备蛋白酶 k 处理的假体1 x 10-2 溶液 (步骤 4.2.3), 如下所示:10μl的 dil1 x10-2 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-3 稀释10μl的 dil1 x10-3 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-4稀释10μoo f dil1 x 10-4 + 90μl 的 h2o = dil1 x10-5 稀释 将从载体中提取的 dna 的序列稀释保存在冰上, 直到将其加载到 qpcr 板上 (第4.3 节)。 基于 sybr 绿色检测的 qpcr 滴定 在 1.5 ml 微离心管中制备 qpcr 主混合物, 用于样品和标准。使用10μl 的 sybr 绿色主混合、1μl 的正向底漆 (10μm 库存)、1μl 的反向底漆 (10μm 库存) 和每反应3μl 的 h2o.有关引物序列, 请参阅表 4中的协议。 移液器的 qpcr 主混合向上和向下, 但不涡流。 加入15μl 的 qpcr 主混合物, 然后加入第4.1 节中制备的标准曲线的5μl 或第4.2 节中从 aav 载体中提取的 dna, 加入每口井。包括三个井, 只包含 qpcr 主混合, 作为一个负对照。有关板材布局, 请参阅图 2 。 用密封膜密封板, 并在4°c 下以 1, 500 x g的速度对 qpcr 板进行简短离心, 时间为30秒。 使用表 5中建议的条件, 在基于平板的实时 pcr 扩增和检测仪器上运行 qpcr 反应。 底漆名称 序列 正向底漆 5 ‘-cccctggcatatcaa-3 ‘ 反向底漆 5 ‘-gcacagtagagtccat-3 ‘ 表 4: 针对 cba 启动子设计的引物序列。 图 2: 基于 qPCR-based 的矢量滴定的板材布局.样品采用彩色编码: 绿色 = 标准曲线;蓝色 = h2o 控制;灰色 = 主要分数;橙色 = 次要部分。请点击这里查看此图的较大版本. 步 时间 温度 周期 目的 预孵化 5分钟 95°c x1 dna 变性和聚合酶活化 (热启动反应)。 放大 10分钟 95°c x1 扩增的 dna。如果使用不同退火温度的替代引物, 则可以优化设置。 10秒 95°c x40 40秒 60°c 1秒 72°c 冷却 10秒 40°c x1 板材冷却。pcr 的结尾。 表 5: 基于 sybr 绿色 qpcr 滴定法的热循环协议。 确定 aav 矢量滴度的数据分析 用第4.1 节中制备的标准样品的不同稀释获得的 ct 值填充电子表格数据单元 (表 6a), 以生成标准曲线。注: 标准曲线的公式将显示 (y = a ln (x) + b) 以及r2效率 (表 6b)。qpcr 的效率必须接近 100%, r2的效率必须接近 1.0 (≥0.96)。 使用a和b的计算值填充电子表格中的相应数据单元格 (表 6c)。 完成电子表格, 其中包含为第4.2 节中制备的 aav 样品的不同稀释获得的 ct 值。 使用以下公式计算 “主要分数” 每微升矢量基因组中的平均 aav 矢量滴度:注: 因子400用于单个搁浅基因组, 而 sc 基因组使用的乘法因子为 20025.事实上, 随着每个 qpcr 周期中 dna 数量的增加, 与 ss 基因组相比, sc dna 检测结果为2倍。滴定法的目的是根据每微升的矢量基因组来计算浓度。在使用2μl 起始材料 (步骤 4.2.1) 时, 运行 qpcr 是必要的。dil表示从4.2.4 步骤开始的稀释因子。”二次” aav 矢量分数 (步骤 3.6) 的滴度可以同时计算。 表 6: 用于 qpcr 数据分析的模板.请点击此处下载此文件. 5. sds-page 和银染色的纯度控制 请注意:该协议的这一部分的性能大约需要5小时。 使用70% 乙醇彻底清洁用于浇铸凝胶的玻璃板。 组装凝胶铸造系统。确保玻璃板的底部没有碎裂, 以防止在铸造凝胶时丙烯酰胺混合物泄漏。 在两个独立的50毫升锥形管中准备堆叠和解析凝胶溶液。省略四甲基乙二胺 (temed) 和 10% (wv) 过硫酸铵 (aps), 因为它们负责凝胶的聚合。在铸造凝胶之前立即添加它们。请注意:凝胶中丙烯酰胺的最终百分比会影响蛋白质的分离分布: 通常情况下, 丙烯酰胺的最终浓度为 10% (vv), 足以测试 aav 载体制备的纯度。 轻轻混合, 旋转含有凝胶成分的管。不要涡流, 因为过量的氧合会损害聚合。 在溶凝胶溶液中加入 temed 和 10% (w/v) aps。混合, 然后倒入凝胶支架, 直到它达到1-2 厘米以下的小玻璃板的顶部。 在丙烯酰胺混合物的顶部放置一层饱和丁醇。这将确保在聚合过程中形成平坦的表面。不要将凝胶放在酒精下超过 30分钟, 因为这会使凝胶脱水并损害其功能。注意: 丁醇在皮肤接触的情况下是危险的。它还带来火灾风险。小心处理。 等待凝胶聚合, 然后倒出丁醇。小贴士: 检查管中多余的凝胶混合物是否已经凝固。聚合发生在不到20分钟内, 用 h2o 清洗凝胶表面, 然后用纸巾将其干燥, 注意不要干扰凝胶表面。 将 temed 和 10% (w/v) aps 添加到堆叠凝胶中, 并将凝胶倒入分离凝胶顶部的凝胶支架中。 将提供的梳子放入凝胶中。用一个稳定的动作来执行这个动作, 以避免井内形成气泡。 等待至少20分钟的凝胶聚合。小贴士: 检查锥形管中多余的凝胶混合物是否已经凝固。 为主要和次要 aav 矢量分数 (分别为步骤3.5 和 3.6) 准备两个混合 (表 7)。 高金额 低金额 aav 矢量库存 5μl 1μl 5倍样品缓冲 3μl 3μl h2o 7μl 11μl 表 7: 银染色所需样品混合物的成分。 在95°c 下加热 5分钟, 使样品混合物完全变性。组装电泳槽, 注意电极方向。 在电极组件内部用1x 阴极缓冲器填充罐, 在外部填充1x 阳极缓冲液。注: 阳极缓冲液可从运行到运行回收。必须始终使用新鲜的阴极缓冲液。 从凝胶中取出梳子, 用1x 阴极缓冲液清洁凝胶的井。 在井里装上1μl 的蛋白质阶梯。在同一凝胶上加载不同井中的样品混合物 (图 3)。在 50 v 处运行凝胶, 直到样品进入解析凝胶。然后将电压增加到 100 v, 直到染料前部达到凝胶的下限。 从玻璃板中仔细提取凝胶, 并使用银染色套件 (根据制造商的说明26) 来可视化构成 aav 衣壳的病毒蛋白 (vp1、vp2 和 vp3 亚基), 并检查是否可能(图 3)。 图 3: 使用 sds-page 和银染色评估矢量纯度.利用三氯素-sds 凝胶, 分离了各种载体制剂的5μl。随后用银染色检测到蛋白质。当 vp1 (82 kda)、vp2 (67 kda) 和 vp3 (60 kda) 以 1:1:10 的比例 (车道 1) 可见时, 矢量被认为是纯的, 没有过多的背景 (车道 2) 或非特异性条带 (车道 3)。请点击这里查看此图的较大版本.