Met behulp van de eencellige Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infecties in Zebrafish larven

Zebravis zorg-, fok- en experimenten die hier beschreven zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en zijn goedgekeurd door de Commissie institutionele dierenwelzijn, van de University of Texas Health Science Center, protocol nummer AWC-16-0127. 1. groei en het onderhoud van Paramecia Verkrijgen live paramecia culturen uit bronnen zoals de zebravis International Resource Center (ZIRC). Uit een levende groeiende cultuur, voeg 1 mL van de paramecia cultuur, 1 mL van een cultuur MG1655 E. coli (optische dichtheid OD600 1.0-2.0) geresuspendeerde in 1 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7.0, steriele), en 8 mL van de 1 x E3 in een maatkolf van 10 mL weefselkweek. Swirl licht en sla bij 22 ° C. Als u wilt een cultuur te behouden, om de twee weken, passage 1 mL van de cultuur van een paramecia in een maatkolf van 10 mL weefselkweek met 9 mL vers 1 x E3 medium met 108 CFU/mL van E. coli MG1655 geresuspendeerde in 1 x E3. 2. bepaling van bacteriële dosis toegediend aan zebravis Bacteriële half-life binnen Paramecium bepalenOpmerking: De halfwaardetijd van bacteriën binnen paramecia wordt bepaald door de beplating levensvatbare E. coli verhaald paramecium, zoals hieronder beschreven. Na een 2 uur incubatie van bacteriën (OD600 voor 1.0) met paramecia bij 22 ° C, de paramecia en co bacteriecultuur in een conische buis van 50 mL te combineren, wassen van de paramecia met 1 x E3, en tellen het aantal paramecia per milliliter (zoals hieronder beschreven in stappen 3.2.7 en 3.2.8). Na het tellen van het aantal paramecia, 50 µL van de paramecia en co bacteriecultuur elk uur (voor 6 h post-exposure) verwijderen en toevoegen van elk monster in een verse 1,5 mL-buis. Plaats 950 µL van 1% nonionic oppervlakteactieve stof (Zie Tabel van materialen) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in elk van de 1,5 mL buizen en vortex voor 1 min lyse van de paramecia. Uitvoeren van 1:10 verdunnen van elk monster met behulp van steriele PBS als een verdunningsmiddel (d.w.z. 100 µL in 900 µL). Plaat 100 µL van elke verdunning op selectieve platen (LB tet medium: 0,5 g/L gistextract, 1 g/L NaCl, 1 g/L trypton, 30 µg/mL tetracycline) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 16 uur. De volgende dag, tellen en registreren van het aantal bacteriële kolonies op de plaat (kolonie vormende eenheden, CFUs) door te tellen alleen de geïsoleerde en verschillende afzonderlijke kolonies. Het identificeren van een plaat met een verdunning die 30-300 kve geeft. Bepalen van de verdunning factor gebruikt. Bijvoorbeeld, als 1 µL van de bacteriële cultuur is gemengd met 99 mL steriele PBS, is dit een 1:100 (0,01) verdunning. Dit nummer wordt het aantal KVE in de verdunningstunnel. De berekening hieronder, voor elk punt van de tijd, om te bepalen van de CFU in de oorspronkelijke steekproef uitvoeren: Berekenen en grafiek van het aantal levensvatbare E.coli/paramecium overeenkomt met de uren post blootstelling met behulp van de paramecia-concentratie berekend in stap 3.3.1 en bepalen de halfwaardetijd binnen het paramecia (Figuur 1). Met behulp van de CFU nummer berekend voor elk punt van tijd, berekenen en grafiek van het aantal levensvatbare E. coli per paramecium op de y-as ten opzichte van de incubatie post uren op de x-as, met behulp van de paramecia-concentratie berekend in stap 3.3.1. De halfwaardetijd in de paramecia te bepalen. Bepalen bacteriële doseren van bacteriële half-life en azen stem.Opmerking: Om te bepalen van de bacteriële dosering, moet de halfwaardetijd van de bacteriën binnen de paramecia en de preying zebravis op paramecia (zie stap 3.4) rekening worden gehouden. Gebruik de volgende formule om te bepalen van bacteriële verval binnen paramecia:(1)Waarbij N0 de eerste hoeveelheid bacteriën per paramecia na de 2 uur incubatie is, Nt is het resterende aantal na tijd t, τ is de tijd waarna het aantal levensvatbare bacteriën is gehalveerd en k de verval-constante. Bepalen van de aantasting van het experiment, de constante k van verval met behulp van de bacteriële halfwaardetijd (dat wil zeggen, de tijd waarna het bedrag van levensvatbare bacteriën/paramecium gehalveerd).(2)Voor de bepaling van half-life, de term en(3) of(4)Opmerking: Gebaseerd op Figuur 1, is de halfwaardetijd van E. coli in paramecia ongeveer 2.3 h. Dus, met behulp van formule (4), het verval rate, k, voor E. coli is:(5) Bepalen van het verval tarief (k) uit het experiment half-life te vinden van de dosis van levensvatbare bacteriën (Nt) in beslag genomen door de larven van de zebravis na azen tijd (t), waar (P) is het preying tarief of het aantal paramecia opgegeten door één vis per uur:(6) of(7)Opmerking: Per Figuur 1is de oorspronkelijke hoeveelheid bacteriën per paramecia (N-0) na een een incubatieperiode van 2 h (t) 790 CFU. Per film 1 en Figuur 2bedraagt de preying (P) 1539. Gebruik deze waarden te vervangen door in vergelijking (7), het berekenen van de bacteriële dosering die wordt verbruikt door een zebravis na een incubatieperiode van 2 h als:(8) 3. voedsel overgedragen infectie van de zebravis Incubeer bacteriën met Paramecia. Bereiden een co cultuur van paramecia en E. coli MG1655 de avond voorafgaand aan de infectie. Combineren van 8 mL E3 media, 1 mL van een cultuur van voortdurende paramecia en 1 mL van een cultuur van de MG1655 E. coli (OD600 = 1.0) geresuspendeerde in 1 x E3 in T25 weefselkweek kolven. Incubeer de kolven op kamertemperatuur (RT) ‘s nachts. Voor elke voorwaarde die behandeling, twee maatkolven van paramecia te bereiden. Inoculeer bacteriegroei media (LB: 1 g/L trypton, 0,5 g/L gistextract, 1 g/L NaCl) met besmettelijke spanning van bacteriën, door het plukken van een individuele bacteriële kolonie van een plaat met behulp van een steriele inoculatie lus. Incubeer de vloeibare cultuur bij 37 ° C en laat schudden bij 110 rotaties per minuut (rpm) ‘s nachts.Opmerking: Persoonlijke beschermingsmiddelen (een laboratorium jas en handschoenen) moet worden gedragen en bioveiligheid niveau 2 voorzieningen moeten worden gebruikt bij de behandeling van infectieuze agentia. Op de volgende dag, meet u de OD600 van de overnachting cultuur. Het volume van cultuur nodig om een OD600 1 wanneer in media 11 mL geresuspendeerde berekenen. Oogst de hoeveelheid bacteriën vanaf stap 3.1.2 via centrifugeren op 6.000 x g gedurende 5 minuten, één volume voor elke Erlenmeyer overgebracht van het paramecia. Verwijder het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 mL E3 media. Optioneel, vooraf vlek de bacteriën met een fluorescente kleurstof. Voeg 1 µL van FM 4-64FX bacteriële vlek (5 mg/mL stockoplossing). Dekken van buis met folie te beschermen tegen photobleaching en incubeer roterende over eind op RT gedurende 15 minuten. Het verwijderen van overtollige kleurstof door wassen met 1 x E3: Pellet bacteriën via centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 1,5 min en resuspendeer de pellet in 1 mL E3 media. Herhaalstap wassen twee keer. Oogst gebeitst bacteriën via centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de bacteriële pellet in 1 mL E3 media. 1 mL van de bacteriële schorsingen toevoegen aan elk van de twee maatkolven van verse paramecia. Incubeer bij RT gedurende 2 uur.Opmerking: Als werken met gekleurd bacteriën, incubeer in het donker bij RT gedurende 2 uur. Wash bacteriën/paramecia co cultuur. De inhoud van beide kolven van paramecia/bacteriën co cultuur in een conische buis van 50 mL te combineren. Centrifugeer steekproeven bij 300 x g bij 15 ° C voor 10 min. Zorg ervoor dat de centrifuge vooraf gekoelde voorafgaand aan deze stap. Verwijderen van ongeveer 10 mL van het supernatans van de E3 met behulp van een precisiepipet serologische en voeg ongeveer 10 mL vers 1 x E3 aan de conische buis.Opmerking: Tijdens alle stappen van de wasbeurt is het essentieel om zeer snel bij het verwijderen van de bovendrijvende substantie, zoals de paramecia beginnen zal om te zwemmen uit de pellet. Spin en bovendrijvende vloeistof verwijderen uit een buis tegelijk om snel genoeg behandeling bij deze stap, en voorkomen dat het verlies van paramecia in het supernatant. Spin monsters via centrifugeren bij 300 x g bij 15 ° C voor 5 min. verwijderen ongeveer 10 mL van het supernatans van de E3 met behulp van een precisiepipet serologische, en voeg ongeveer 10 mL vers 1 x E3 aan de conische buis. Herhaal deze stap tweemaal. Centrifugeer steekproeven bij 300 x g bij 15 ° C gedurende 5 min. verwijderen ongeveer 10 mL van het supernatans dat E3, niet te verstoren de pellet verzorgen. Resuspendeer de pellet in de overblijvende 10 mL van E3 media en breng 500 µL van de schorsing in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. Pellet de 500 µL van paramecia door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 min om het aantal paramecia te tellen. 400 µL van het supernatant E3 uit het monster 500 µL verwijderen. 20 µL van 36,5% formaldehyde-oplossing toevoegen aan de resterende 100 µL paramecia zachtjes resuspendeer en incubeer gedurende 5 min bij 22 ° C.Opmerking: Deze stap doodt de paramecia toe om te tellen. Het meten van feitelijke totale volume met behulp van het pipet en record. Verdun de paramecia schorsing 1:1 v/v met 0,4% trypan blauwe oplossing. Een cel teller of hemocytometer gebruiken om te tellen van het aantal dode paramecia/mL.Opmerking: Vanwege de voorafgaande fixatie stap, zal de meeste paramecia dood op dit punt, maar dit nummer weerspiegelen het aantal levende paramecia voor de co incubatie-experiment. De auteurs hebben niet gevonden significante paramecia overlijden ten gevolge van bacteriële co incubatie, zodat dit kan worden genegeerd als een factor is hier. Samen Paramecia en zebrafish larven uit te broeden. Bereken de concentratie van paramecia:Opmerking: Deze berekening geeft de concentratie van paramecia in de conische tube van 50 mL uit stap 3.2.5. Bereken het volume van de gewassen paramecia nodig voor een concentratie van 2 x 10,5 paramecia/mL in een eindvolume van 3 mL E3.Opmerking: De concentratie van paramecia kan worden aangepast op basis van de gewenste bacteriële dosering, die onderworpen aan de optimalisatie is. Zebravis anesthetize door toevoeging van tricaïne in 100 mM Tris pH 8,0 tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg/L. overdracht 10 zebrafish in elk putje van de plaat van een 6-well in een totaal volume van 3 mL verse E3 met de juiste concentratie van paramecia (berekend in stap 3.3.2). Zorg ervoor dat overdracht van de larven in een minimale hoeveelheid vloeistof, zodat ze herstellen van verdoving in de ontvangende put. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2 uur in een diurnale incubator onder daglicht omstandigheden, om te zorgen voor optimale bliksem voorwaarden voor azen. Zebravis minstens 5 keer wassen door de overdracht van vis in een nieuwe goed met 3 mL verse E3 met 100 mg/L tricaïne elke keer.Opmerking: Probeer niet de tricaïne tijdens het wassen stap weglaten. Overdracht van mobiele larven zonder verdoving, verhoogt het risico van schade en leed aan het dier. Optioneel, voorbereiden zebrafish beeldvorming door inbedding zebrafish in 3 mL 1% laag-smelt agarose in een zwart-ommuurde 6-well plaat: Low-smelt agarose is aangelengd met 1xE3 en verwarmd in een magnetron. Zodra gesmolten, tricaïne aan een eindconcentratie van 160 mg/mL toevoegen. Standpunt vis onder een stereomicroscoop, met behulp van een geknipte gel laden tip, ervoor te zorgen dat het hoofd aan de linker- en de staart is is aan de rechterkant (Figuur 3). Wacht 5 minuten voor de agarose om in te stellen, dan de ingesloten vis met 1 x E3 met 160 mg/mL tricaïne voor imaging-overlay. De preying tarief bepalen.Opmerking: Geen aparte experiment moet worden ingesteld om te bepalen van de preying tarief. Integendeel, dit kan gebeuren tijdens stap 3.3.4, zoals hieronder beschreven. Tijdens stap 3.3.4, zebravis azen op een stereomicroscoop en vangen videobeelden van het vangen van de prooi te bekijken. Score van de videobeelden. Vangen van de prooi wordt gekenmerkt door het slaan van zebravis richting de prooi. Elke staking tellen als een prooi vangen gebeurtenis, hoewel dit slechts een benadering is (Zie discussie). Bereken het gemiddelde aantal prooi vangen gebeurtenissen per uur van meerdere videoclips, elk vertegenwoordigt een verschillende zebrafish larve (Figuur 2).