Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas¹. Notavelmente, deteção de fluorescência da atividade de cada enzima tem sido usada para investigar a heterogeneidade das enzimas atividade^2,3 ou descobrir o efeito de memória so-called (períodos de atividade de enzimas alta sucedido por períodos de baixa atividade e vice-versa)^4,5.

Muitos estudos única enzima exigem que as enzimas são imobilizadas na superfície ou espacialmente fixo em outra maneira de manter-se suficientemente longo no campo de visão para observação contínua. Encapsulamento de enzima em lipossomas foi mostrado para habilitar a imobilização da enzima, evitando qualquer impacto negativo devido a superfície-enzima ou proteína-proteína interações^6,7. Além disso, os lipossomas oferecem uma possibilidade única de estudar proteínas de membrana única em sua natural lipídios BICAMADA ambiente^8,9,10.

Uma classe de proteínas de membrana, transportadores, exerce uma translocação direcional de substâncias através da membrana celular, um comportamento que pode ser estudado somente quando as proteínas são reconstituídas para o lipid bilayers (por exemplo, os lipossomas)^{11, 12,13}. Por exemplo, translocação de protões, exibida por várias enzimas das cadeias de transporte electrónico de procariontes e eucariontes, desempenha um papel importante na respiração celular através da criação de uma força motriz protónica usada para a síntese de ATP. Neste caso, o próton atividade de bombeamento é acoplado à transferência de elétrons, embora o mecanismo detalhado deste processo muitas vezes continua elusivo.

Recentemente, temos demonstrado a possibilidade de detecção fluorescente de casal com eletroquímica para estudar próton bombeamento a atividade das enzimas única da terminal ubiquinol oxidase de Escherichia coli (citocromo bo₃) reconstituído em lipossomas¹⁴. Isto foi conseguido através do encapsulamento de um corante fluorescente-membrana impermeável de sensíveis ao pH no lúmen de lipossomas preparados a partir de E. coli lipídios polares (figura 1A). A quantidade de proteína foi otimizada, assim que a maioria dos lipossomas também continham nenhuma ou apenas uma molécula de enzima reconstituído (de acordo com a distribuição de Poisson). Os dois substratos do citocromo bo₃ foram fornecidos pela adição de ubiquinona à mistura lipídica que formou os lipossomas e oxigênio (ambiente) em solução. Os lipossomas são, então, escassamente adsorvidos em um eletrodo de ouro ultra-suave semi transparente, coberto com uma monocamada auto montada de 6-mercaptohexanol. Finalmente, o eletrodo é montado na parte inferior de uma célula de spectroelectrochemical simples (figura 1B). Controle eletroquímica do estado redox quinona piscina permite flexìvel acionar ou parar a reação enzimática, a qualquer momento, enquanto a tintura sensíveis ao pH é usada para monitorar as alterações de pH dentro do lúmen dos lipossomas como resultado da translocação de protões pelo enzimas. Usando que a intensidade de fluorescência de uma segunda, lipid-limite tintura fluorescente, o tamanho e volume de lipossomas individuais pode ser determinada e, portanto, a quantificação do próton enzima atividade de bombeamento. Usando esta técnica, nomeadamente encontramos que moléculas de citocromo bo₃ são capazes de entrar em um estado de fuga espontânea que dissipa-se rapidamente a força motriz protónica. O objetivo deste artigo é apresentar a técnica de medições em lipossomas único em detalhe.