Colletotrichum fioriniae Desarrollo en agua y extractos florales basadas en cloroformo arándano y arándano

1. aislamientos y suspensiones de esporas Aislante fioriniae Colletotrichum de un anfitrión infectado naturalmente19. A continuación, almacenar los cultivos limpios en harina de maíz agar (CMA) sesgos. Colocar el tapón de la cultura (de inclinación de CMA) en una celda de plástico estándar cultura plato (9 cm diámetro) que contiene que ya sea clarificado agar de jugo V8 (cV8A) (modificado de Miller 1955), o no aclarado zumo de V8 agar (V8A)20. Cuando las colonias comienzan a esporular, raya conidios (masas conidiales naranja) a otro cV8A o V8A que contiene la placa de cultivo celular (con un asa estéril estándar) para producir una cultura esporulación alta densidad.Nota: Los pasos de protocolo con hongos se deben realizar en una campana de Flujo Laminar para reducir la posibilidad de contaminar culturas fungicidas o pruebas biológicas. Después de 7 días de crecimiento, utilizando un asa estéril estándar reunir una pequeña cantidad de conidios de la cultura de alta densidad (al tocar ligeramente el bucle a la masa de conidios) y esto mezcle en un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 10 mL de agua desionizada estéril (SDW). Vórtice de esta muestra de 10 s, luego con ayuda de una pipeta estándar sumergirse hacia arriba y hacia abajo varias veces a la mezcla más la muestra. Luego, coloque una gota de la muestra de agitarse en el hemocitómetro y estimar concentraciones de esporas. Cuenta de 5-10 campos en el hemocitómetro, obtener la media y media se multiplican por el factor de dilución (es decir, 10.000), obteniendo así la concentración de conidios por mL SDW. Luego, usando un volumen (V) / ecuación de la concentración (C) (V1● [C1] = V2● [C2]) ajustar (con SDW) a 1.0 X 105 conidios por mL de SDW con un volumen final de 5 mL. Esto se conoce como la suspensión de esporas y sólo se hace inmediatamente antes de usarlo en cualquier prueba. 2. activos, extractos florales a base de agua (activo -FE)15,16 Nota: Ver suplementario Figura 1, suplementario Figura 2, figura 3 complementariay película suplementario 1. Cuidadosamente mano-recoger arándanos (abril-mayo) y arándanos (junio-julio) flores durante sus floraciones del pico respectivo en el campo (suplementario Figura 1). Desgaste y cambiar los guantes de nitrilo entre ubicaciones de muestreo (localizaciones de cultivares, variedades, físico) para inhibir la contaminación del aceite de la piel humana así como la contaminación cruzada entre las variedades florales. Coloque flores de arándano o arándano (de una sola fuente) en bolsas de plástico (llenar una bolsa de 100 x 150 mm) e inmediatamente refrigerar a 4 ° C una vez que se recogen flores.Nota: La extracción de activos se modifica de Leandro et al. (2003) 16. Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos, luego utilizando flores saludables quitar los ovarios, sépalos y pedúnculos con fórceps curvado (pinzas de 45 °) y descarte. Utilice sólo los restantes órganos (corola, estigma, estilo y estambres) para activos – extracciones. Cortar tela (150 x 150 mm) dentro de un embudo de 7 x 7 mm, colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL limpio y reservar. Combinar 1 parte procesado flores en 9 partes SDW (1 peso: relación vol 9) en un mortero. Suavemente, moler con un mortero para 30 s (tenga cuidado de no totalmente pulverizar las muestras). Colar la pulpa resultante a través del embudo de tela preparada y recoger en tubo de centrífuga (50 mL). Limpie o use nuevo mortero/Maja entre cada extracción con 95% EtOH y agua corriente tibia. Preparar un aparato de filtración de vacío: se reúnen el Embudo Buchner, matraz de Erlenmeyer vacío del filtro (capacidad de hasta 1.000 mL), papel de filtro de 55 mm círculo y fuente de manguera de vacío. Añadir papel de filtro en un embudo de Buchner tamaño apropiado y coloque en el matraz, entonces conecte el aparato a un agua fuente con manguera de succión y dejar de lado. Aclarar aún más los extractos de flores de arándano por centrifugación 10 min a 8.055 x g. Vierta el sobrenadante en aparato de filtro de vacío preparados, encienda la fuente de vacío, filtrar el sobrenadante, luego Vierta el contenido del matraz en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL). Limpie todos los componentes del aparato entre cada filtración 95% EtOH y agua corriente tibia. Filtro adicional a través de una jeringa adaptada con un 0.22 μm tamaño de los poros, acetato de esterilización, filtro en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL). Para los extractos florales arándanos, vacío sólo filtrar con papel de filtro y vierta el contenido del matraz en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL). Preparación resultante se denomina activo- extracto floral (activo -FE). Almacenar todo a base de agua florales extractos (activo- pasivo-, colecciones del agua de lluvia) a-20 ° C en alícuotas de 5-50 mL hasta uso experimental. Repetición de extracciones con múltiples muestras (al menos 3 extracciones por tipo de muestra) para proporcionar repeticiones. 3. pasiva , extractos florales a base de agua ( pasar -FE) 16 Nota: Ver pelicula complementaria 2. A mano de flores recoger arándanos enteros (50 g) que el anterior y refrigere después de recoger. Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos y quite sólo los pedúnculos de flor intacta. Refrigerar muestras preparadas hasta que el pasivo – sistema de extracción, que se describe a continuación, en el lugar. Enjuague todos los componentes antes 95% etanol (EtOH) y agua corriente tibia para prevenir la contaminación (hoja de malla de plástico, dos canastas de malla de plástico, molde de pan de cristal y botella de nebulización bomba). También preparar un tubo de centrífuga de estopilla/embudo/50 mL de 4 capas para cada extracción como se describe anteriormente (en el paso 2.2) y ponga a un lado. Preparar el tamiz: Coloque una hoja de malla de plástico (aka clara barra estera) en cesta de una malla de plástico (114 x 102 mm). Coloque una canasta de malla en segundo lugar, idéntica, al revés (invertida) en un vidrio-bandeja para pan (127 x 229 mm) (para evitar flores en SDW) y coloque la malla hoja que contiene la cesta encima. Añadir 50 g de flores preparados en el tamiz.Nota: Como alternativa, cestas de pequeño tubo de ensayo [limpieza] pueden utilizarse en lugar de las cestas de malla de plástico originalmente usados (viejo, verde, fresa malla pinta cestas son a menudo difíciles a la fuente). Flores de niebla con 250 mL con una bomba de niebla botella y uniformemente capturan de escorrentía en la bandeja de pan de cristal. Luego cuele filtrado a través del estopilla/embudo preparado en un tubo de centrífuga limpio. Preparación resultante se denomina pasiva- extracto floral (pass -FE); almacenar como por arriba (paso 2.6). Limpie todos los componentes entre cada extracción con 95% EtOH y agua corriente tibia. Repetición de extracciones con muestras múltiples para proporcionar repeticiones (por lo menos 3 por tipo de muestra). 4. cloroformo a base de extractos florales (ch-FE) 17 Recoger flores de arándano y el arándano como por arriba (paso 2.1) y preparar las flores para la extracción (paso 2.2, sin preparación de estopilla/embudo). Mantener flores preparadas refrigeradas hasta antes de su uso. Cualquier trabajo realizado con cloroformo debe realizarse en una campana de humos por razones de seguridad. Esto incluye la preparación de materiales / cristalería, procedimientos de extracción y conductancia de prueba (pasos con ch-FE). Limpiar todos los componentes con un 95% EtOH dos veces, luego dos veces con cloroformo para evitar la contaminación para cada extracción: roscado de tubos de cultivo de vidrio, 2 vasos de precipitado de vidrio, rejilla de acero inoxidable pequeño y un cilindro graduado [vidrio]. Dejar de lado a seco boca abajo. Enjuague tapas de politetrafluoroetileno (PTFE) alineado dos veces con 95% EtOH (cloroformo dañará los materiales del exteriores de la tapa) y dejar de lado que se seque. Combinar 1 parte procesado flores en 9 partes de cloroformo (1 peso: relación vol 9) en un vaso de precipitados (flores entonces cloroformo), suavemente remolino para 30 s y la tensión a través de una pantalla de acero inoxidable en el segundo vaso. Vierta ch-FE del segundo vaso en el tubo de la cultura de cristal (10-15 mL) y fije el tapón PTFE. Envuelva la tapa con parafilm para evitar la evaporación. Esta preparación es el extracto floral basada en cloroformo (ch-FE). Almacenar la muestra en la oscuridad (para reducir la degradación de la luz) a 4 ° C hasta su uso experimental. Repetición de extracciones con muestras múltiples para proporcionar repeticiones (por lo menos 3 por tipo de muestra). 5. recogida de aguas pluviales de flores de arándano (BB rw-FE)16 Nota: El dispositivo de recolección de agua de lluvia floral de arándanos consiste en una taza de rocío de aire pistola pintura desechables con adaptador de conexión (Copa: rosca, adaptador: rosca macho a macho), tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm y () cables revestido plástico cable de teléfono estándar, contenido de filamento de alambre interno individual). Seleccione varias ubicaciones dentro de un arbusto de arándanos para captar agua de lluvia correr fuera de flores antes de crear dispositivos para la recolección. Estos incluyen directamente debajo de las inflorescencias (flor) a la base de la zarza (corona). Registro de diámetro de los tallos (desde 1-5 cm) en lugares seleccionados, ya que esto determinará el tamaño de agujeros utilizados para la fijación del dispositivo, que se describe a continuación. Para cada ubicación seleccionada crear un dispositivo de la colección. Taladre un agujero en la parte inferior de la taza de spray (donde la Copa curvas hacia la apertura de rosca) con el correspondiente diámetro de tallo, con un poco de paso a una prensa del taladro. Luego, cortar una línea recta desde la parte superior del fondo a la boca de la Copa de rocío. Taladro 4 agujeros equidistantes (suficientemente grandes para roscar el alambre revestido de plástico), en la boca de la Copa de rocío y conecte un extremo de los cables revestidos plástico dejando un extremo libre. Perfore un agujero lo suficientemente grande para Enrosque el adaptador de taza de pulverizador de pintura de una tapa de tapa de centrífuga de 50 mL. Sellar las roscas del adaptador con parafilm para evitar fugas. Conecte este a la tapa de centrífuga y la parte roscada de la Copa del rociador. Conecte el tubo de centrífuga de 50 mL acoplado. Repita los pasos 5.4 5.3 para crear múltiples dispositivos según las localizaciones, un mínimo de dispositivos de captación 4 por localidad de muestreo. Implementar dispositivos en lugares seleccionados por flexión tazas rociador para acoplarse a los tallos. Orientar el lado cortado de la Copa de rocío hacia arriba usando los cables recubiertos de material plástico a otros tallos (para asegurar el agua que pasa sobre flores es capturado). Colocar parafilm las aberturas que podrían tener fugas de agua de lluvia. (Suplementario Figura 3, suplementario figura 4, suplementario Figura 5y suplementario Figura 6). Tubos de etiqueta con el despliegue de fecha / hora. Después de un evento de lluvia, remover y reemplazar la parte inferior (tubo) del tubo de centrífuga (etiqueta de fecha / hora de recogida). Traer colecciones de escurrimiento (denominados Extracto de flores de agua de lluvia de arándano (rw-FE de BB)) dentro y vacío filtro (filtración descrito en pasos 2.4-2.5). Tienda como arriba (paso de 2.6), hasta que en un bioensayo con base de agua. 6. recogida de aguas pluviales de las flores de arándano (CB rw-FE) El dispositivo de recolección de agua de lluvia floral en arándanos consiste en un embudo de polipropileno 7 X 7 cm, tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm, y 4 estándar, de plástico revestido lazos de torcedura (por dispositivo). En primer lugar, calor pinche 8 agujeros equidistantes (diámetro de lazos de torcedura) alrededor de la boca del embudo utilizando una sonda de metal. Inserte lazos de torcedura de 4. Conecte los otros extremos a ubicación opuesta agujeros, formando un patrón de cruce aseado. Enrolle abajo-vástago del embudo con parafilm y apartar. Perfore un agujero lo suficientemente grande como para insertar el vástago de abajo del embudo en una tapa de centrífuga de 50 mL con un poco de paso. Inserte el embudo preparado en la tapa de la centrífuga. Repita los pasos 6.2-6.3 para crear múltiples dispositivos, un mínimo de dispositivos de captación 4 por localidad de muestreo. Implementar dispositivos de etiquetado (fecha/hora) en pantanos de arándanos seleccionados. Cuidadosamente doble dos flor cojinete inflorescencias (conocidas como montantes) bajo los lazos de giro plástico cruzados. Luego orientar verticalmente el dispositivo por la perforación del tubo de centrífuga en el dosel del arándano (suplementario figuras 7-8, suplemento 3 de la película). Después de un riego de lluvia o arriba Quite y vuelva a colocar la parte inferior (tubo) del tubo de centrífuga (etiqueta de fecha / hora de recogida). Traigo escurrimiento (denominado Extracto de arándano rojo lluvia floral (CB rw-FE)) dentro y vacío filtro (filtración descrito en pasos 2.4-2.5). Tienda como arriba (paso de 2.6), hasta que en un bioensayo con base de agua. 7. bioensayos con extractos florales en base de agua15,16 (activo-FE, pasar-FE, FE de rw) Nota: Vea la figura 1. Este bioensayo se prepara en una campana de Flujo Laminar. Preparar materiales: Enjuague triple vidrio cubreobjetos con 95% EtOH y aire seco, entonces se puso a un lado. Cortar discos de toalla de papel para el diámetro interno de un platos de cultivo celular de plástico estándar (9 cm). 2 capas de discos de papel dentro de platos de la cultura y poner en remojo con 2 mL SDW. Preparar por lo menos 5 mL de 1.0 X 105 conidias por cada mL de suspensión de esporas SDW (C. fioriniae) como por arriba (paso 1.2-1.4), a un lado. A continuación, mezclar volúmenes iguales de SDW y basados en agua floral extracto en 2 mL tubos de microcentrífuga. Luego, añadir un volumen igual de la suspensión de esporas en los tubos de microcentrífuga de preparados 2 mL (SDW más FE); la preparación resultante se conoce como una mezcla de tratamiento acuosa. Para el control, omitir parte de FE y reemplazar con SDW, para mantener constantes las concentraciones de conidios.Nota: tamaño de porción depende de número de repeticiones y los puntos de tiempo. Por lo general, las porciones no excedan 500 μl. Una vez que se combinan los conidios y FE la prueba biológica ha comenzado, post-inoculación de 0 h. Colocar el cubreobjetos de vidrio previamente limpiado encima de las toallas de papel empapadas dentro de la placa de cultivo celular. Coloque una gota de 40 μl de mezcla de tratamiento acuosa en el centro de un cubreobjetos. Repetición de tratamientos deseados, incluyendo el control, cierre la placa de cultivo celular. Repita en platos de cultura independiente de la célula para replicaciones (menos 3) y el tiempo (cada plato es de 1 punto). Una vez que han salido todos los tratamientos y repeticiones, coloque todos platos de cultura células replicadas en un envase plástico sellado (30 x 13 x 7 mm) e incubar a 25° C en la oscuridad. En momentos predeterminados, añadir 10 μl de un fijador como el azul algodón de lactofenol (cristales de fenol de 20,0 g, ácido láctico de 20,0 mL de 2,5%, 40,0 mL glicerol, algodón 0.05 g azul) a las gotitas, detener el crecimiento y la conservación del Monte. Esperar 2 h para recoger el momento 0 h como esto permite conidial adherencia a la superficie de vidrio pero no es tiempo suficiente para la germinación de conidios. Todos los otros puntos de tiempo, añadir fijador al tiempo correspondiente. Una vez que se ha añadido un fijador, invertir con cuidado el cubreobjetos, colocarlas lado gota en un portaobjetos de vidrio para facilitar el examen microscópico (1 cubreobjetos por diapositiva). Cuando los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio, dejar que se colocan y parcialmente seco en la campana de flujo por 20 min. Los conidios (conidias total) presentan en el cubreobjetos (conidios primarios conidios germinados y conidios secundarios recién formados) así como apresorios en cualquiera de los dos 400 X aumentos (contando 16 campos) o 200 X (contando 4 campos), cuenta con un total de un área de 3,808 mm 2. replicar toda prueba biológica para el análisis estadístico. Para los ensayos con FE a base de agua, análisis de datos como se describe en Waller et al. 201716, normalmente viendo como media count/m2 (total conidios o apresorios). 8. bioensayo usando cloroformo basado en extractos florales (ch-FE)17 Nota: Véase la figura 2. Preparar materiales y platos de la cultura como por arriba (pasos 7.1) de la célula. Además, un número igual de Van Tieghem (células VanT.) enjuague (8 m m OD, ID 6 mm) a cubreobjetos y una pipeta de vidrio (1 mL con incrementos de 1 μl) dentro de una campana de humos, (dos veces con 95% EtOH luego dos veces con cloroformo) y reservar. En campana de flujo laminar, utilizando un tubo de microcentrífuga de 2 mL agregar dos volúmenes iguales (porciones de al menos 500 μl) de SDW y 1 volumen de suspensión de esporas, y luego apartar. Esta es la mezcla de tratamiento acuosa para bioensayos ch-FE. En una campana de humos, colocar un VanT. celular en un cubreobjetos de vidrio dentro de la placa de cultivo celular de plástico preparada. Añada (con pipeta de vidrio) 33 μl de deseada ch-FE en el centro de la célula de T. Van (no toque las paredes de lo VanT. Célula; para el tratamiento de control, añadir cloroformo Virgen) y dejar para secar. Repita en platos de cultura independiente de la célula para replicaciones (menos 3). Ch-FE ha secado, dispensar 99 μl de la mezcla de tratamiento acuosa preparada con una pipeta estándar en el centro de lo VanT. celular, a continuación, cierre todos platos de la cultura de la célula. Una vez que la mezcla de tratamiento acuosa ha entrar en contacto con los tratamientos de secado ch-FE, la prueba ha comenzado, post-inoculación de 0 h. Una vez que han salido todos los tratamientos y repeticiones, coloque los platos de cultura de célula (cerrada) en un envase plástico sellado (30 x 13 x 7 mm) e incubar a 25° C en la oscuridad. En momentos predeterminados, añadir 15 μl de un fijador (lactofenol azul algodón) a la VanT. célula y dejar sentado durante al menos 5 minutos asegurar adecuada tinción de hongos. Después de ese tiempo, retire con cuidado el VanT. celular y siga los pasos de cubreobjetos inversión y datos de adquisición anteriormente (pasos 7.5-7.6). Para análisis de datos, siga los métodos descritos en el diseño 201517, suelen Mostrar datos como formación de apresorio, cuál es la proporción de conidios total a apresorios en la zona observada (3,808 mm2). 9. arándano extracciones basados en la fenología17 Mano recoger flores de arándano (en junio; 100 g), no maduro fruta (dos veces; Julio y agosto; 200 g) y madurar fruta arándano en la cosecha (octubre; 200 g), colocar en bolsas de plástico de tamaños adecuado y refrigerar a 4 º C inmediatamente después de su obtención. Tome las precauciones de contaminación mencionadas anteriormente (paso 2.1).Nota: Habrá material extra planta recogido en cada momento, pero estas cantidades protección contra extracción de ovarios infectados obviamente hongos y frutas (mostrando síntomas y signos de enfermedad). Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos y luego utilizando flores sólo sanas, eliminar los sépalos, pedúnculos, corollas, estigmas, estilos y estambres con fórceps curvado (pinzas de 45 °) y deseche todo menos los ovarios. Una vez recopilados los ovarios, realizar la extracción de cloroformo basado en un 1 peso: 9 relación de vol (detallado en pasos 4.2-4.4, usando sólo los ovarios). Almacenar las muestras hasta que todas las extracciones son completas, es decir, hasta la conductancia de la prueba biológica. Una vez que los frutos se recogen, realizan una extracción basada en cloroformo (pasos 4.2-4.4, con recogida fruta en lugar de flores), pero añadir 10 g de fruta a 90 mL de cloroformo y una vez extrajeron, deje que la solución se evaporan 9 mL (dando por resultado un peso de 9 mL de 10 g: : solución de vol). Hacer extracciones de fruta inmediatamente después de recoger en julio, agosto y octubre. Guardar como por arriba (paso 4.4) hasta que se recogen todas las extracciones. Después de la última extracción de fruta basada en cloroformo, sujetos todos los extractos de cloroformo basado en Penología recogidos de este análisis a la prueba biológica basada en cloroformo y en consecuencia analizar (pasos 8.1-8.6).