리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스
Summary
이 프로토콜 모두 시각적으로 통신 brainstem 척수 준비 하 고 포괄적인 단계별 방식 brainstem 가로 조각의 준비를 명확히. 그것은 재현성을 증가 하 고 brainstem의 호흡 영역에서 신경 출력 기록 가능한, 오래 지속, 컬 활성 분할 영역 취득의 가능성을 강화 하도록 설계 되었습니다.
Abstract
포유류 inspiratory 리듬의 모 수는 preBötzinger를 복잡 한 전화 (pBC), 운전 inspiratory 근육의 리듬 수축 신호를 생성 하는 영역에 신경 네트워크에서 생성 됩니다. 리듬 신경 활동 pBC에서 생성 하 고 호흡의 근육 신경 녹음 및 가로 분할 녹음 일괄적 포함 하 여 다양 한 방법을 사용 하 여 공부 될 수 드라이브에 다른 신경 풀에. 그러나, 이전에 게시 방법을 설명 되지 않은 광범위 하 게 brainstem 척수 해 부 과정 미래 연구에 대 한 투명 하 고 재현 가능한 방식. 여기, 우리 사용 reproducibly 리듬-액티브 brainstem 조각을 생성 하 고 전송 inspiratory 드라이브에 대 한 필요 하 고 충분 한 신경 회로 포함 하는 방법의 포괄적인 개요를 제시. 이 작품은 pBC, hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 신경의 출력을 기록에 대 한 실용적이 고 컬 활성 분할 영역을 안정적으로 얻기의 가능성을 향상 시키기 위해 이전 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜 구축 및 hypoglossal 모터 신경 (XII 미네소타)입니다. 제시 하는 작품 XII rootlets를 포함 하는 생체 외에서 슬라이스를 전체 쥐 강아지에서 해 부의 상세한, 단계별로 그림을 제공 하 여 이전 게시 된 방법에 따라 확장 합니다.
Introduction
Brainstem의 호흡 신경망 리듬 신경 네트워크의 일반적인 특성을 이해 하기 위한 비옥한 도메인을 제공 합니다. 특히, 관심 신생아 설치류 호흡 및 호흡 리듬을 개발 하는 방법을 이해의 개발 이다. 이 비보 전체 동물 plethysmography, 체 외에서 일괄적 신경 녹음, 포함 한 다단계 접근 방식을 사용 하 고 생체 외에서 수 있습니다 호흡 리듬 생성기를 포함 하는 녹음을 슬라이스. 시험관 en 블록 및 슬라이스 녹음에서 reductionist 호흡기 rhythmogenesis 및 설치류 개발의 brainstem 척수 영역에서 신경 회로 뒤에 메커니즘을 심문 할 때 사용 하는 유리한 방법입니다. 개발 호흡기 약 40 세포 유형을, 패턴, 중앙 호흡기1,2의 포함을 발사 하 여 특징을 포함 한다. 중앙 호흡기 네트워크 rostral ventrolateral 모1,3에 위치한 컬 활성 뉴런의 그룹을 포함 합니다. 포유류의 호흡기 rhythmogenesis 생성 되는 autorhythmic에서 interneuron 네트워크 불리는 복잡 한 preBötzinger (pBC), 되었습니다 통해 실험적으로 지역화 신생아 포유류의 조각 및 en 블록 준비 brainstem 척추 코드3,,45,6,,78. 이 지역에에서 동방 마디 (SA)에 비슷한 기능을 제공 하 고 드라이브 호흡을 inspiratory 타이밍 시스템을 생성 합니다. PBC에서 inspiratory 리듬 brainstem (hypoglossal 모터 핵 포함) 및 척추 모터 풀 (예: 격 막 드라이브 인할지 모터 뉴런)9의 다른 지역에 수행 됩니다.
리듬 활동 brainstem 척수 en 블록 준비 또는 다양 한 c 3-c 5 신경 rootlets, XII 신경 rootlets를 포함 하는 세포 인구에서에서 분할 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다 hypoglossal 모터 핵 (만 12 세), hypoglossal premotor 신경 (XII pMN), 그리고 pBC3,10,,1112. 데이터 수집의 이러한 방법은 실험실의 소수에 걸쳐 성공 했습니다, 여러 프로토콜 하지 새로운 연구 분야를 입력에 대 한 완벽 하 게 재현할 수 있는 방식으로 표시 됩니다. 취득 가능한 컬 활성 en 블록 슬라이스 준비는 해 부와 슬라이스 절단 프로토콜의 모든 단계를 통해 세부 사항에 급성 주의가 필요 합니다. 이전 프로토콜 광범위 하 게 설명 하는 다양 한 기록 절차와 전기 생리학, 아직 실행 가능한 조직 준비의 가장 중요 한 부분에 세부 부족: brainstem 척수 해 부 및 조각 절차를 수행.
제대로, 신중 하 게, 그리고 신속 하 게 모든 단계를 수행 수 해야 효율적으로 얻기 컬 활성 및 가능한 en 블록 또는 슬라이스 준비 brainstem 척수 전기 생리학 기록 (일반적으로, 전체 절차 관련 여기 있을 수 있습니다 약 30 분에서 수행). 있다 하지 이전 잘 설명 하는 brainstem 척수 전기 생리학 프로토콜의 중요 한 포인트 포함 신경 rootlets 및 조각화 절차는 vibratome에의 해 부. 이 프로토콜 stepwise 첫 번째는 새로운 연구와 분야에서 전문가 위한 brainstem 척수 해 부에 시각적으로 의사 소통입니다. 이 프로토콜도 철저 하 게 외과 기술, 랜드마크, 및 조각 및 각 실험에서 원하는 정확한 회로 포함 하는 준비 일괄적 표준화에 미래 연구자를 지원 하기 위해 다른 절차를 설명 합니다. 쥐와 쥐 신생아 강아지에 여기에 제시 된 절차를 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
En 블록으로 여기에 제시 된 프로토콜 적응 또는 슬라이스 워크플로 실험실 용 유리 이며 얇은 중 일괄적 brainstem-척수를 활용 하 고 싶은 연구 슬라이스 전기 생리학 기록에 대 한 준비. 해 부와 슬라이스 방법 제시, 방법과 다른 사람에 의해 이전에 보고 된17,,1819결합, 널리의 범위에 적응할 수 있는 강력 하 고 가능한 조직의 재…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.B.P은 Loma Linda 대학 여름 학부 연구 화목의 받는 사람입니다.
Materials
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405-1KG | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma Aldrch | S9638-25G | |
| CaCl2•2H2O | Sigma Aldrich | C7902-500G | |
| MgSO4•7H2O | Sigma Aldrich | M7774-500G | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270-1KG | |
| Cold-Light source Halogen lamp 150W | AmScope | H2L50-AY | |
| Dissection Microscope | Leica | M-60 | |
| Vibratome 1000 Plus | Vibratome | W3 69-0353 | |
| Magnetic Base | Kanetic | MB-B-DG6C | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| Sword Classic Double Edge Blades | Wilkinson | 97573 | |
| Histoclear | Sigma-Aldrich | H2779 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5/45 Forcep | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handel #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Spring Scissors Straight | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Narrow Pattern Forcep Serrated/straight | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors; Straight | Roboz | RS-5650 | |
| Vannas Scissors 3" Curved | Roboz | RS-5621 | |
| Insect pins, 0 | Fine Science Tools/8840604 | 26000-35 | |
| Insect pins, 0, SS | Fine Science Tools | 26001-35 | |
| Insect pins, 00 | Fine Science Tools | 26000-30 | |
| Insect pins, 00, SS | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Insect pins, 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| Insect pins, 000, SS | Fine Science Tools | 26001-25 | |
| Minutien pins, 0.10 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Minutien pins, 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Minutien pins, 0.2 mm | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Fisher Tissue prep Parafin | fisher | T56-5 | |
| Graphite | fisher | G67-500 | |
| Delrin Plastic | Grainger | 3HMT2 | |
| 18 Gauge Hypodermic Needle | BD | 305195 |
References
- Hilaire, G., Duron, B. Maturation of the Mammalian Respiratory System. Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).
- Pinkerton, K. E., Joad, J. P. The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children’s Health. Environmental Health Perspectives. 108, 6 (2000).
- Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals. Science. 254, 726-729 (1991).
- Smith, J. C., et al. Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model. Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).
- Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping. The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).
- Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons. Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).
- Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).
- Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far. Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).
- Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex. Journal of Neuroscience. 20, 113 (2000).
- Rousseau, J. -. P., Caravagna, C. Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording. Journal of Visualized Experiments. , e53071 (2015).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Koizumi, H., et al. Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro. Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).
- Danneman, P., Mandrell, T. Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats. Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).
- Umezawa, N., et al. Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats. Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).
- Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups. Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).
- Formenti, A., Zocchi, L. Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats. Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).
- Negro, C. A. D., et al. Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation. Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).
- Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex “Island”. Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).
- Funk, G. D., et al. Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene. Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).
- Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).
- Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro. NeuroReport. 6, 165-168 (1994).
- Ruangkittisakul, A., et al. High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices. Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).
- Rybak, I. A., et al. Modeling the ponto-medullary respiratory network. Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).
- Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated ‘sandwich’ slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons. Physiological Reports. 2, (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2008).
