De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. ¹ het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. ^{2 , 3} nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. ⁴ de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en genoom replicatie, suggereert dat chromatine is een zeer dynamisch systeem gratis. ^{5 , 6 , 7} inzicht in de dynamische eigenschappen van DNA op verschillende niveaus van de chromatine is uitermate belangrijk voor het ophelderen van genetische processen op moleculair niveau waar fouten tot celdood of de ontwikkeling van ziekten zoals kanker leiden kunnen. ⁸ is een eigenschap van de chromatine van groot belang is de dynamiek van nucleosomes. ^{9 , 10 , 11 , 12} de hoge stabiliteit van deze deeltjes is toegestaan voor de karakterisering van het structurele door kristallografische technieken. ² wat deze studies ontbreken zijn de dynamische details van nucleosomes zoals het mechanisme van DNA uitpakken vanuit de kern van Histon; de dynamische route die is vereist voor replicatie en schrijffouten en andere processen. ^{7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16} bovendien speciale eiwitten remodelleert factoren genoemd is gebleken om de demontage van nucleosomal deeltjes¹⁷; de intrinsieke dynamiek van nucleosomes is echter de kritieke factor in dit proces dat tot het gehele demontage proces bijdraagt. ^{14 , 16 , 18 , 19}

Single-molecuul technieken zoals single-molecuul fluorescentie^19,20,21, optische overlapping (pincet)^13,18,22,23 en AFM ^{10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26} zijn instrumentaal in het begrip van de dynamiek van nucleosomes. Tussen deze methoden, AFM profiteert van diverse unieke en aantrekkelijke functies. AFM maakt het mogelijk om te visualiseren en karakteriseren van individuele nucleosomes evenals de langere matrices²⁷. AFM beelden, kunnen belangrijke kenmerken van nucleosoom structuur zoals de lengte van DNA de Histon kern gewikkeld worden gemeten ^10,14,26,28; een parameter die centraal staat in de karakterisering van nucleosoom uitpakken dynamiek. Verleden AFM studies is nucleosomes zeer dynamische systemen en dat DNA spontaan vanuit de kern Histon^{14 uitpakken kunt}gebleken. De spontane uitpakken van DNA van nucleosomes was direct gevisualiseerd door AFM actief zijn in de modus time-lapse wanneer de beeldvorming wordt gedaan in waterige oplossingen ^14,26,29.

De komst van de snelle time-lapse instrumentatie van de AFM (HS-AFM) maakte het mogelijk om te visualiseren van het proces nucleosoom uitpakken op de milliseconde tijdschaal ^14,15,24. Recente studies van de³⁰ van HS-AFM ^16,van centromeer specifieke nucleosomes geopenbaard verschillende nieuwe functies van de nucleosomes vergeleken met het canonieke type. Centromeer nucleosomes vormen van een centromeer, een klein deel van het chromosoom cruciaal voor chromosoom segregatie³¹. In tegenstelling tot canonieke nucleosomes in bulk chromatine bevat de kern Histon van centromeer nucleosomes RETOREN-A Histon in plaats van Histon H3^32,33. Als gevolg van deze substitutie Histon, is DNA inwikkeling in centromeer nucleosomes ~ 120 bp in plaats van de 147 ~ bp voor canonieke nucleosomes; een verschil dat tot verschillende morphologies van de centromeer en canonieke nucleosomes leiden kan arrays³⁴, suggereren dat centromeer chromatine ondergaat hogere dynamiek in vergelijking met het grootste deel een. De nieuwe dynamiek weergegeven door centromeer nucleosomes HS-AFM^16,30 studies illustreren de unieke kans geboden door de techniek van deze single-molecuul te visualiseren direct de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Voorbeelden van deze functies zal kort worden besproken en geïllustreerd aan het einde van het papier. Deze vooruitgang geboekt als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe protocollen voor AFM beeldvorming van nucleosomes, alsmede de wijzigingen van bestaande methoden. Het doel van het protocol hier beschreven is vooruitgang te boeken deze spannende in single-molecuul AFM nucleosoom studies toegankelijk voor iedereen die graag gebruik maken van deze technieken in hun onderzoek van de chromatine. Veel van de beschreven technieken zijn van toepassing op problemen buiten de studie van nucleosomes en kunnen worden gebruikt voor onderzoek van de andere eiwitten en DNA systemen van belang. Een paar voorbeelden van dergelijke toepassingen kunnen worden gevonden in publicaties^35,36,^{,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49} en vooruitzichten van AFM studies verschillende biomoleculaire systemen worden gegeven in^29,50,51,53,^,54Beoordelingen.