האבחון של מחלת הירשפרונג על-ידי חיסוני שאיבה רקטלי ביופסיות עבור Calretinin, S100 חלבון וחלבון מוצר גן 9.5
Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך העיבוד החיסוני שאיבה רקטלית ביופסיה עבור calretinin, S100 חלבון, חלבון מוצר גן 9.5. שיטת האבחון החדשנית של מחלת הירשפרונג מעדיפה רגישות ותעריפים מסוימים.
Abstract
מחלת הירשפרונג (HD) היא מחלת מעיים מולדת אשר מתבטאת קלינית כחוסר יכולת לעבור meconium בתינוקות או עצירות לטווח ארוך אצל ילדים. ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB) כדי לקבוע את העדר של תאים גנגליון והיפרפרס עצביים הוא המבחן המדויק ביותר עבור האבחנה של HD כיום. המטאוקסילין המסורתי-אאוזין מכתים חסר רגישות וספציפיות. כתמים אצטילכולין אסטראז לא ניתן להשתמש באופן נרחב עקב התהליך המורכב שלה. הפרוטוקול הרומן שלנו של כתמים עבור calretinin, חלבון S100, וחלבון מוצר גן 9.5 (PGP 9.5), אשר אנו מתנהלים על RSBs, תצוגות רגישות גבוהה ושיעורי ספציפיות של 96.49% (95% מרווח ביטחון, 0.88-0.99) ו 100% (95% ביטחון מרווח, 0.97-1.00), בהתאמה. מקטעים מושפעים HD לעתים קרובות להציג כהעדר הביטוי של calretinin, S100 חלבון, ו PGP 9.5, אשר הם סמנים של היפרפרס עצבי ברקמת submucosal. פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההפעלה המפורט של שיטת אבחון חדשה זו.
Introduction
מחלת הירשפרונג (HD) היא הפרעת מעיים שכיחה בבטן מולדת המאופיינת בהעדר תאים גנגליון בחלקים שונים של מערכת העיכול1. מערכת העצבים האנושית נוצר כאשר הפלישה של התאים העצביים העובריים הושלמה. אם יש הפרעה של התהליך ואת הפלישה נכשל להשלים, המעי המרוחק של היילוד הופך aganglionic2. המצב הקטלני הזה נקרא מחלת הירשפרונג. התפשטות, תנועתיות וגידול במעיים הם שלושת המרכיבים העיקריים של הקולוניזציה המוצלחת.
המטאוקסילין מסורתית ו אאוזין (H & E) כתמים של ביופסיה מוגבלת submucosal לא יכול להגיע כגורם משביע רצון של התוצאה כמו H & E כתמים של רקמה בעובי מלא שהתקבלו מהניתוח. בנוסף, אצטילכולין אסטראז (כאב) כתמים של רקמת שאיבה רקטלית הוא מאתגר תיאורטית בשל הרגישות שלה מספיק, שהוא 91%, ועיבוד מורכב של סעיפים קפואים3,4. מספר סמנים אימונוהיסטוכימיה אחרים של תאים גנגליון וסיבי עצב שניתן לוכתם ב-formalin קבוע ו פרפין מוטבע דגימות בהדרגה להפוך את האבחון המיינסטרים HD. Calretinin הוא ויטמין D תלויי-חלבון מחייב סידן שאינו מתבטא במיקלעת myenteric ו submucosal של מקטעים מושפעים HD5. חלבון S100 מתבטא בתאים הנגזרים מהרכס העצבי, כגון סיבי עצב ותאי גליה, אשר לעתים קרובות מציגים היפרפרס עצביים ברקמת המשנה של מקטעים מושפעים של HD6. גן חלבון מוצר 9.5 (PGP 9.5) כתמים באופן אמין סיבי עצב ו גנגליון תאים; PGP 9.5 כתמים מעשים כתוספת calretinin כתמים, במיוחד במקרים של היפוגנגלארי מבודדים. מכתים כפול עם S100 ו PGP 9.5 יכול להקטין את שיעור שלילי שלילית ולהגדיל את הרגישות. כתנאי מוקדם, המחקר הנוכחי שואפת להבטיח ספציפיות הולם רגישות גבוהה של שיטה זו אבחון הרומן. הפרוטוקול הרומן שלנו השתמש בכל שלושת הסמנים לאפליה של aganglionic מעי וסיבי עצב יפרטרופית. מחקר פוטנציאלי של 318 ילדים בוצע על ידי המעבדה שלנו ופורסם בעבר ללא פרוטוקול מפורט7. הפרוטוקול המפורט ואמצעי הזהירות נדונים במאמר זה. כל neonates שסבלו מבעיית הצואה חמור מאז הלידה או הילדים עם עצירות כרונית למעט מחלות נפוצות אחרות הם מועמדים פוטנציאליים ביופסיה שאיבה רקטלית (RSB). הפרוטוקול הרומן שלנו מתאים לצביעת לא רק RSBs אלא גם ביופסיות בעובי מלא או דגימות כירורגי כדי לבצע אבחנה סופית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן תיארנו הליך באמצעות שלושה נוגדנים אימונוהיסטוכימיה שונים כדי להכתים סעיפים RBS לאבחון של HD. הרגישות של פרוטוקול האבחון שלנו היה 96.49% (95% CI, 0.88-0.99), והספציפיות היתה 100% (95% CI, 0.97-1.00).
הצעדים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם התגובה RSB ונוגדן אנטיגן. גודל הביופסיה קובע את הדיוק של הה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לweibing טאנג על עזרתו הגדולה במתן מעבדת הצילום. מאמר זה נתמך על ידי מחקר הרווחה הציבורית, וקרנות מיוחדות התקבלו מן הבריאות הלאומית ותכנון המשפחה של סין (גרנט No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
