Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Las células inmunes son las células más móviles del cuerpo humano y a menudo deben lidiar con la fuerza de esquileo del flujo sanguíneo y linfático. Sin embargo, hay relativamente pocos estudios sobre la migración de inducida por la fuerza de esquileo de leucocitos^1,2,3,4,5. Aquí presentamos un protocolo confiable y cuantitativo para analizar la respuesta de una célula inmune al flujo in vitro. Realizar el análisis no requiere la fabricación de componentes, y todos los equipos y consumibles están comercialmente disponibles. El protocolo, incluyendo análisis de la depuración y migración de la célula, se puede realizar en un solo día. Finalmente, aunque se describe la migración de células B de zona marginal (MZBs), se puede adaptar el protocolo para analizar la migración contra flujo de otros tipos de células inmunes. Por lo tanto, es factible utilizar este ensayo para analizar sistemáticamente una amplia gama de los leucocitos con un panel amplio de condiciones.

MZBs son una población de células B que en el ratón, sólo se encuentran en el bazo y el transporte entre el interior de los folículos y los marginales^6,7,8,9. La zona marginal es una capa de células de células inmunitarias aproximadamente 5 – 10 gruesas. La capa de la célula envuelve el folículo y consta principalmente de MZBs y macrófagos, pero también invariantes naturales killer (iNKT) las células T, células dendríticas (DCs) y neutrófilos, entre otros¹⁰. Las células de la zona marginal se exponen al flujo unidireccional de sangre procedentes de las arterias esplénicas que terminan en un seno marginal que rodea el folículo. La sangre fluye de los orificios en el seno marginal a través de la zona marginal es recopilada en los senos venosos de la pulpa roja y restaurada la circulación¹¹. El libre flujo de la sangre lava sobre el MZBs y expone a los antígenos en la sangre. El MZBs llevan el antígeno en el folículo por trasladar automáticamente entre la zona marginal y el interior del folículo, que no está expuesto a la sangre. Así, como lanzadera de MZBs hacia el folículo, debe migrar la fuerza de esquileo del flujo arterial¹² (figura 1A).

En este protocolo, se describe cómo determinar cuantitativamente cómo las células inmune tales como MZBs respuesta in vitro de alto flujo o no flujo, para revelar cómo están programados para migrar en vivo. En el primer paso, MZBs son purificadas de un bazo de ratón mediante bolas magnéticas acopladas a anticuerpos de kits disponibles en el mercado. MZBs recientemente aisladas son introducidos en el pozo de una diapositiva de la cámara de flujo, les permitió asentarse en ligandos de integrinas y expuestas al flujo del tampón de migración usando un sistema de bomba (figura 2A). Las células son imágenes mediante un sistema de microscopia video Time-lapse. Las imágenes son luego procesadas para el análisis con un plugin gratuito de ImageJ, MTrack2^13,14, para seguir automáticamente las células. Las pistas pueden cuantificarse entonces la libre Ibidi quimiotaxis herramienta¹⁵ para determinar varios parámetros como velocidad, rectitud y el índice de migración. Estos valores pueden utilizarse para determinar los efectos de los inhibidores de la migración, estimuladores de células, quimiocinas y otros productos químicos que afectan la migración en la migración de esquileo del flujo inducido para entender las fuerzas que controlan el movimiento de células inmunitarias en vivo.