Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

De biotrophic pathogen Ustilago maydis is de verwekker van de maïs smut ziekte¹. Het infecteert alle luchtfoto delen van maïs resulterend in grote tumoren die melanized, zwarte sporen bevatten. Op mondiaal niveau, wordt U. maydis geraamd op een jaarlijks verlies van ongeveer 2% van de opbrengst van maïs, veroorzaken terwijl tumoren worden gewaardeerd als een gastronomische delicatesse in Mexico. Infectie van de plant wordt geïnitieerd door een appressorium die scheidt van de celwand lysing enzymen te dringen de eerste laag van maïs epidermale cellen. Van een primaire infectie site, U. maydis groeit intracellulair en intercellularly, invasie van één tot twee cel lagen elke dag^1,2. Succesvolle infectie resultaten in hypertrofie van de plant dat in zichtbaar tumoren op vijf dagen verandert post infectie^1,3,4. Tijdens alle stadia van de infectie invaginate schimmeldraden van de schimmel de plant cytoplasma membraan zonder ieder rechtstreeks contact naar de host cytoplasma^1,2. De strakke apoplasmic ruimte tussen de infecteren schimmeldraden en de plant plasmamembraan wordt beschouwd als de host/pathogen interactieve site, genaamd de biotrophic interactie zone. Om te overwinnen van het aangeboren immuunsysteem van de plant, scheidt U. maydis een array van effector eiwitten in de biotrophic interactie zone¹. Sommige effectoren worden overgenomen door plantencellen, terwijl anderen in de biotrophic interactie zone^{5,6,7,8 blijven}. Één die apoplastisch effector is UmPit2, die samenwerkt met die apoplastisch maïs proteasen het vrijkomen van de signalering peptide ZmZIP1 van ZmPROZIP door die apoplastisch protease activiteit^9,10te voorkomen.

In de afgelopen decennia, U. maydis werd niet alleen een model voor schimmel genetica in plant-pathogen interactions, maar ook een waardevol hulpmiddel in de biotechnologie als gevolg van een goed begrepen life cycle, genetische bereikbaarheid en heterologe uitdrukking van uitgescheiden eiwitten^11,12,13. Signalen voor de secretie van zowel conventionele en onconventionele eiwit zijn vastgesteld waarmee de posttranslationele modificaties¹⁴. Onlangs, U. maydis was werkzaam als een paard van Troje hulpmiddel om te studeren klein, maïseiwitten in situ¹⁵uitgescheiden. Het paard van Troje aanpak werd met succes gebruikt voor het analyseren van de functie van de kleine, secreted eiwit ZmMAC1 dat is betrokken bij helmknop ontwikkeling. ZmMAC1 induceert de periclinal verdeling van pluripotente cellen en cel lot specificatie van de nieuw gevormde cellen¹⁵. Op dezelfde wijze, werd de biologische functie van de maïs schade-geassocieerde peptide ZmZIP1 geopenbaard. U. maydis afscheidende de maïs die zmzip1 resulteerde in verminderde tumor vorming¹⁰. Dus, het paard van Troje aanpak vormt een waardevolle alternatieve route naar eiwit in situ studies met hoge Spatio resolutie dat noch doet vereisen generatie van stabiele maïs transformatie lijnen noch weefsel infiltratie met geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten. In het bijzonder, maakt het paard van Troje-strategie de secretie van een heteroloog eiwit in de maïs apoplast en directe vergelijking van besmette versus niet-besmette plantencellen binnen de dezelfde weefsel.

Dit protocol illustreert de belangrijke stappen voor het genereren van een soort paard van Troje U. maydis om een proteïne van belang bestuderen. Verder bevat precieze informatie over infectie procedures van drie verschillende maïs weefseltypes (HLA) (volwassen bladeren, kwastjes en oren) met U. maydis, dat is een voorwaarde voor het bestuderen van de spatio infectie progressie en eiwit-functie in deze onderzoeken weefsels. Geen bijkomende specificaties zijn bepaald op maïs gene versterking en microscopische beeldvormende technieken, aangezien deze stappen doelgroepen gerichte en instrument-afhankelijk zijn. Dus, dit protocol is bedoeld voor ervaren gebruikers van standaard moleculaire biologietechnieken.