NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー

1. 準備 ½ 培地、培寒天培地の pH 5.7 ないのスクロース (1 L) を準備します。 超純水水 950 mL の培地、培 (MS) 基礎培地の 2.2 g を溶解します。5 m 島 5.7 に pH を調整します。 純水で 1 L の最終巻にソリューションを構成します。500 mL のペットボトルを 2 つ、各含んでいる 1% 植物寒天に分割します。121 ° C、20 分でのオートクレーブ。 ¼ MS 液体 pH 5.7 ないのスクロース (1 L) を準備します。 超純水水 950 mL で MS の 1.1 g を溶解します。5 m 島 5.7 に pH を調整します。純水で 1 L の最終巻にソリューションを構成します。500 mL のペットボトルを 2 つに分割します。121 ° C、20 分でのオートクレーブ。 GA4を準備します。 GA4 100 mM GA4在庫の最終濃度エタノール 70% を溶解します。 実用的なソリューションを準備、希釈する GA4株式の 0.1-1 ¼ MS 液体 pH 5.7 μ M。 2. 植物の成長 シロイヌナズナの種子を滅菌します。 化学のフードを使用して動作します。2 mL 遠心チューブに分注種 (約 200 種)。耐塩素用インクとマーカーを使用し、滅菌容器 (封印できる大型ボックス) 内オープン蓋管を配置します。 50 mL の超純水の殺菌容器内ナトリウム次亜塩素酸溶液 50 mL を含む 250 mL ビーカーを置きます。 ビーカーに塩酸 (HCl) 3 mL を追加します。すぐに容器を密封し、6-16 h の塩素ガスによる殺菌を許可します。 容器を開封後種子ラックにすべてのマイクロ遠心チューブ用の蓋を閉じます。メッキの時まで乾燥滅菌種子を格納できます。 ½ MS 寒天培地角皿に約 20 の滅菌シロイヌナズナの種をまきます。多孔性のサージカル テープでプレートをシールし、アルミ箔でそれらをラップします。成層の 1-3 日のための 4 ° C でそれらを孵化させなさい。 ルート イメージング プレートを垂直に成長室に次の成長条件が 3 日間転送: 長日条件 (LD、闇の光/8 h の 16 h);120 µmol⋅m-2の-1光強度。(光周期) の間に 22 の ° C の (暗いサイクル) の間に 18 ° C 温度 65% 相対湿度 (RH)。 暗所で育てた胚軸: 発芽を同期する 1-4 h の光パルスの成長室にプレートを転送します。アルミ箔と板をラップし、3 日間の垂直に成長室に配置します。 3. サンプル準備 定常測定 (図 1 a) きれいな顕微鏡スライド (さあ今からモック ソリューションとしてと呼ばれる) ¼ MS 液 50 μ L を追加します。軽くスライドする板から nlsGPS1 を表現する苗を転送します。 きれいな観察を取るし、カバーガラスのそれぞれの角に真空用グリースの滴をスポットします。優しく、coverslip の苗を置き、慎重に空気の泡を削除する余分なモックのソリューションを追加します。 GA4治療: 化学実験 (図 1 b). GA4治療の前に長方形を描きます (ピペット先端部に添付) 真空グリースでいっぱい 20 mL 注射器を使用 (長さ: 3.5 cm の高さ: 2.5 cm) きれいなガラス スライド (図 1 b) の真空用グリースの均一層で。可能にする真空用グリースの微妙な境界線、ピペット先端部は直径 1 mm の開口部を持ってにカットする必要があります。 スライド ガラスにモック溶液 50 μ L を追加します。きれいな鉗子 nlsGPS1 苗を選ぶし、モックのソリューション上に静かに置いてください。損傷を防ぐため、生検鉗子で苗を把握せず、子葉の下側をサポートすることで苗を転送します。 きれいな観察を取るし、カバーガラスのそれぞれの角に真空用グリースの滴をスポットします。鉗子を使用して、真空グリース四角形の中心に、coverslip を配置します。今、coverslip、真空グリース長方形の長い辺に対応する 2 つの側面にシールされます。 慎重に貯水池を埋めるためし、内部 seedling(s) を乱すことがなくタンク内空気の泡を削除する余分なモックのソリューションを追加します。 共焦点顕微鏡を用いた GA4処理の前に、画像を取得します。このプロトコルのセクション 4 で説明した指示に従います。 GA4治療のためには、共焦点の段階から顕微鏡スライドを削除します。20 分のタイマーを設定します。 タイマーを起動した後、¼ MS 液 1 μ M GA4を含む緩衝液を交換します。Coverslip の左側から GA4ソリューション (約 50 μ L) を追加し、右側から前 (モック) ソリューションを削除します。約 10 分 (図 1 b) を乗せたモックのソリューションを完全に置換するソリューションを交換で維持します。 顕微鏡ステージ上にスライド ガラスを配置します。GA 後イメージを取得する前に、別の 10 分を待ちます。 興味の組織の時間経過の設定します。注:例えば、興味の組織では胚軸や根があります。我々 は日常的に商業灌流システムを使用して nlsGPS1 バイオ イメージングの時間コースを実行 (図 1表の資料を参照してください) または RootChip7,10,11。 粘着性があるスライドの灌流チャネルの中心にモック溶液 200 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。優しく nlsGPS1 苗を選ぶし、粘着性があるスライドでモックのソリューションの上に置きます。 鉗子を使用して、優しくガラス基板を配置、粘着性があるスライドの周囲に粘着性の材料との強い絆を形成、coverslip の外側のエッジを軽く押します鉗子の裏面を使用して。 2 肘ルアーロックを使用して (0.8 mm 内径 [ID]) を使用してコネクタと、番号 (0.8 mm)、シリコーン チューブは、20 mL の注射器と回収流出液出口コンテナーは粘着性があるスライド接続します。シリコン チューブに注射器を接続する (0.8 mm の ID) を持つルアー ロック コネクタを使用します。 含む十分な溶液商工会議所、商工会議所に気泡がないように手動で模擬液注射器を優しく押します。置き、プログラム可能なシリンジ ポンプにシリンジを保持します。 シリンジ (すなわち.、径と体積) 流量ポンプのマニュアルによると、特定のポンプのパラメーターを設定します。注:このプロトコルでは 1-3 mL/h の流量が使用され、これは実験の要求に応じて変更できます。時間のコースを開始するには、ポンプを始動します。 GA4処理時間コース (図 1) に、ポンプを置くことで、血流を停止および GA4と補われる新しい 1 つ含む ¼ MS 液体で、注射器を変更します。次のセクションで示すように、共焦点レーザー顕微鏡を続行します。 4. 顕微鏡 注:我々 は、共焦点レーザー顕微鏡を実行します。 レーザーを搭載した共焦点顕微鏡を使用して FRET イメージングを実行する画像を取得します。注:NlsGPS1、シアンの蛍光蛋白質 (CFP) および黄色い蛍光蛋白質 (YFP) の亜種が作成されます。このプロトコルでは商業顕微鏡 (テーブルの材料1 と 2 の顕微鏡として記載されているを参照してください) は、10 倍や 20 倍乾燥 0.70 高調波複合 PLAN APO 目標で使用されます。 顕微鏡 1、使用 448 nm および 514 nm の波長レーザー CFP と YFP をそれぞれ刺激します。逐次スキャンを取得します。CFP の励起後 CFP (ドナー排出) 460-500 nm と YFP (フレット排出) 525-560 nm を検出する検出器 (HyD SMD など) を設定します。2 番目のシーケンスを使用して、YFP の励起後の YFP (YFP 排出) 525-560 nm を検出する検出器を設定します。注:この YFP の蛍光は、商業の 3次元顕微鏡可視化と解析ソフトウェアを使用してサーフェスを生成する式コントロールとしてだけでなく、核をセグメント化に使用されます。 顕微鏡 2、使用 440 nm および 514 nm 波長レーザー ライン CFP と YFP をそれぞれ刺激します。2 つのトラックを取得します。トラック 1、YFP (フレット排出) の CFP の励起後 CFP (ドナー排出) 464-500 nm と 526-562 nm を検出する検出器 (例えば.、ChS) を設定します。トラック 2、YFP の励起後の YFP (YFP 排出) 526-562 nm を検出する検出器をセットします。注:この YFP の蛍光は、3次元可視化・解析ソフトウェアでサーフェスを生成する式コントロールとしてだけでなく、核をセグメント化に使用されます。 512 x 512 ピクセルの形式と 12 ビットの解像度を使用して画像を取得します。 利得はないピクセルを飽和しながら良好な信号を許可する経験的に決定される値を調整する必要があります。CFP とフレットの放出実験を間、ゲインを変更しないでください。1 風通しの良い単位 (AU) にピンホールを設定します。共焦点顕微鏡のステージに IBIDI の粘着性があるスライドを置き、前述示されているイメージングを続行します。 顕微鏡 1 ソフトウェアの中ライブ スキャンをアクティブ利用上/下で光るイメージ画面の左上に位置する露出不足と関心領域の彩度を決定します。顕微鏡 2 ソフトウェアで利用する範囲のインジケーターイメージ画面の下側に位置する露出不足と関心領域の彩度を決定します。ための定量的画像解析は、ピクセルの彩度がない必要があります。 1 μ m のステップ サイズの z スタックを設定します。ステップ サイズを増加 z 解像度の削減または取得またはイメージを作成することができます位置/サンプルの数を増やすに増加速度の増加します。自動時間のコースを設定した時間間隔で画像を取得する z スタック (集録モード] タブから xyzt モード) と一緒に時間を設定します。 5 フィジーを用いた画像解析 注:ImageJ (フィジー) を使用して画像データを処理し、シロイヌナズナnlsGPS1 排出量比率の 2 次元 (2 D) 画像を生成することが可能です。画像の例については、図 2 a 2 C、 2 e 2 G、および3 aを参照してください。ImageJ は、検索機能を使用してこのプロトコルの各コマンドを見つけることが可能です。コンピューターのキーボードのスペースバーと Lを押します。新しいウィンドウが開きます。検索フィールドに必要なコマンドを入力します。 フィジー (画像 J) にファイル (.lif または .lsm ファイル) をドラッグしてハイパー スタックとして画像を開きます。 メイン メニューから、画像を選択 >スタック> Z プロジェクトと選択合計スライス最大投影のように明るいピクセルだけではなく、すべてのピクセルをキャプチャします。 メイン メニューからプロセスを選択 >減算背景とセット ローリング ボール半径 50 ピクセル。その他のオプションの選択を解除し、すべての 3 つの画像を処理します。この手順では、「ローリング ボール」アルゴリズムを使用して背景を削除します。注: 50 ピクセル、経験的に前景として核を含むように決め。 メイン メニューから、画像を選択 >色>チャンネルの分割。3 つの新しいウィンドウが開きます: C1 合計(CFP チャンネル);C2 合計(フレット チャネル)、およびC3 合計(YFP チャンネル)。 C3 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス)し画像ノイズを低減する 1 のガウスぼかしを適用します。 メイン メニューから、画像を選択 >調整>明るさ/コントラスト自動選択。 メイン メニューからプロセスを選択 >コントラストを強調、およびセット飽和= 0.35。 メイン メニューからイメージを選択 >タイプ> 8 ビットと 8 ビット イメージにスタックを変換します。 メイン メニューから選択イメージ>調整>自動ローカルしきい値。自動ローカルしきい値で、次のパラメーターを選択: Phansalkar メソッド、半径 = 15、パラメーター 1 = 0、パラメーター 2 = 0、および白のスタック。このステップでは、YFP スタックはバイナリ マスクを作るに使用されます。 C2 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス) 1 のガウスぼかしを適用します。 C1 合計ウィンドウを選択し、メイン メニューからプロセスを選択 >フィルター >ぼかし (ガウス) 1 のガウスぼかしを適用します。 メイン メニューから、2 つのチャンネルから排出比スタックを作成するプロセスを選択 >イメージ電卓。イメージ 1、として選択してC2 合計が表示され、新しいウィンドウ演算子として分割を選択し、2 のイメージとしてC1 合計を選択します。 新しいウィンドウを作成して32 ビット フォーマットを選択することを確認します。新しいウィンドウは、名前付きC2 合計結果が表示されます。 メイン メニューから、画像を選択 >ルックアップ テーブル> LUT 16_colors。 メイン メニューからプロセスを選択 >イメージ電卓。イメージ 1、として選択してC2 合計結果が表示され、新しいウィンドウで、演算子として乗算を選択し、画像 2 としてC3 合計を選択します。この手順で YFP バイナリ マスク、YFP 制御チャンネルにあるピクセルのみを表示する YFP/CFP スタックで乗算されます。 メイン メニューからプロセスを選択 >数学>分割し、値を 255 に設定します。新しいウィンドウが開いたら、はいスタック内のすべての画像を分析するを選択します。新しいイメージは、名前付きの結果の結果の C2-合計が表示されます。 メイン メニューから選択イメージ>調整>明るさ/コントラスト、自動選択。 メイン メニューからプロセスを選択 > 選択してコントラストを強調、飽和型 = 0.35。 メイン メニューから、画像を選択 >調整> GA 分布をキャプチャする明るさ/コントラスト、および最小値と最大値を設定します。オプションのステップ: メイン メニューから分析を選択 >ツール>校正バーとバーを LUT 校正、.tiff ファイルとして結果の結果の C2 の合計を保存。 排出量の値を取得する比率は、メイン メニューから、分析を選択 >設定測定し平均グレー値を選択、標準偏差。 ツールバーから四角形を選択、利益 (率 ROI) の領域を描画します。メイン メニューから分析を選択 >メジャー。新しいウィンドウ選択した投資収益率からの平均値が報告されます。 コピーし表計算ソフト (Excel、OriginPro) に得られた値を貼り付けるし、実験前に、と後 GA4治療のためヒストグラムまたは実験時間コースの線グラフを作る。 6. 画像解析 3次元可視化と解析ソフトウェアを使用して 注:選択したソフトウェアを使用する利点 (材料の表を参照)、セグメント オブジェクト (例えば、核)、共焦点の z スタックから 3次元画像を作成します。イメージの例として、図 2 b 2 D、 2 階 2 H、 3 bを参照してください。 ソフトウェアを開き、ファイル (.lif または .lsm ファイル) をインポートします。 サーフェス ウィザードを使用してコントロール YFP 放出チャネルに基づいて核をセグメント化します。セグメント化されたオブジェクトは、「表面」と呼ばれます。この分割ステップは、核外ボクセルから背景を除去しながら 1 つのオブジェクトとして核でのすべてのボクセル解析を許可します。 サーフェス ウィザードで 3 μ m と既定値にしきい値を背景差分 (ローカル コントラスト) を設定します。CFP 放出 (ドナー励起ドナー排出 [DxDm])、YFP 放出 (受容体受容体励起蛍光 [AxAm]) チャネルを使用して作成したサーフェスに基づいてフレット放出 (ドナー励起アクセプター発光 [DxAm]) チャンネルをマスクします。 XT 意味強度比拡張機能を使用すると、ドナー励起アクセプター発光ドナー励起ドナー蛍光 (DxAm/DxDm) 2 つのチャネルで個別のサーフェスの平均輝度値の間で割った値の比率を計算します。注:この拡張機能はオンライン ダウンロード中です。 NlsGPS1 排出量の比率と個々 のサーフェスの色、統計と色分け、カラー ホイールのアイコンとして表されますを選択します。統計の種類としては、強度比を意味するを選択します。 統計情報] アイコンの下にある表から個々 の値の比をエクスポートします。 コピーし値をスプレッドシートに貼り付けるし、GA4治療実験前に、と後のヒストグラムまたはコースの実験時間のグラフを作る。 7. 統計解析 注:NlsGPS1 排出量比の beeswarm、ボックス プロットの3 D を図を参照してください。 ソフトウェアを開き、Y 列として核表面の放射率を貼り付けます。 目的の列を選択し、統計を選択 >統計データ>正常テストサンプルが正規分布するかどうかを知っています。正規性検定を実行し、新しいウィンドウが開き、結果を報告します。 サンプルが正規分布の場合は、 tを使用して-統計的なテストとしてテストします。統計を選択 >仮説検定>行の 2 標本 t 検定とtの実行-テストします。 サンプルが正規分布していない場合選択統計>統計仮説検定> サンプル間の差異が大きな違いではないかどうかを知る2 つの標本分散のテストをします。 差異は、大きな違いはありません、検定としてマン-ホイットニーの U 検定テストを使用します。統計を選択 >ノンパラ メトリック テスト>マン-ホイットニーのテストし、テストを実行します。 分散が大幅に異なる場合、検定としてクラスカル ・ ウォリス ANOVA テストを使用します。統計を選択 >ノンパラ メトリック テスト>クラスカル ・ ウォリス分散分析をテストし、テストを実行します。