Ein Rhodopsin Transport Test von High-Content Imaging-Analyse
Summary
Wir beschrieben hier, ein High-Content bildgebendes Verfahren zur Quantifizierung des Transports von Rhodopsin Mutanten mit Retinitis Pigmentosa verbunden. Eine Multiple-Wellenlänge scoring Analyse wurde zur Rhodopsin Proteine auf der Zelloberfläche oder in der ganzen Zelle zu quantifizieren.
Abstract
Rhodopsin Fehlfaltung Mutationen führen zum Stab Photorezeptor Tod, die manifestiert als autosomal dominante Retinopathia Pigmentosa (RP), eine Progressive Verblindung Krankheit, die wirksame Behandlung fehlt. Wir vermuten, dass die Zytotoxizität des mutierten fehlgefaltete Rhodopsin gelindert werden kann, indem Sie pharmakologisch stabilisieren das mutierte Rhodopsin-Protein. P23H Mutation, unter die andere Klasse II Rhodopsin Mutationen, kodiert ein strukturell instabil Rhodopsin mutierte Protein, das in das endoplasmatische Retikulum (ER), akkumuliert wird, während das Wildtyp Rhodopsin in der Plasmamembran in Säugetieren transportiert wird Zellen. Wir zuvor eine Lumineszenz-basierte Hochdurchsatz-Screen (HTS) durchgeführt und identifiziert eine Gruppe von pharmakologischen Chaperonen, die den Transport von das P23H Rhodopsin aus ER auf die Plasmamembran gerettet. Hier quantifiziert ein Immunostaining Methode, gefolgt von einer hohen bildgebenden Inhaltsanalyse, wir den mutierten Rhodopsin Protein Betrag in die ganze Zelle und auf die Plasmamembran. Diese Methode ist informativ und effektiv, um wahre Hits aus Fehlalarme nach HTS identifizieren Die High-Content Bildanalyse ermöglichte darüber hinaus mehrere Parameter aus einem einzigen Experiment auszuwertende die pharmakologischen Eigenschaften von jeder Verbindung zu quantifizieren. Mit Hilfe dieser Assay, analysierten wir die Wirkung von 11 verschiedenen Verbindungen in Richtung sechs RP verbundenen Rhodopsin Mutanten, erhalten ein 2-D pharmakologischen Profil für eine quantitative und qualitative Verständnis über die strukturelle Stabilität dieser Rhodopsin-Mutanten und Wirksamkeit verschiedener Verbindungen in Richtung dieser Mutanten.
Introduction
Protein misfolding ist Muskeldystrophie sowie neuronale Degenerationen und blendende Krankheiten, einschließlich Retinitis Pigmentosa (RP)1beteiligt. RP ist eine vererbte und progressive Degeneration der Netzhaut Mutationen in mehr als 60 Gene beeinflussen die Funktion und die Homöostase des Stabes Photorezeptoren oder die Netzhaut pigmentiert Epithele (RPEs)2,3zugeordnet. Keine wirksame Behandlung gibt es derzeit für RP. Rhodopsin Mutationen entfallen etwa 25-30 % der autosomal-Dominant (n. Chr.) RP-Fällen. Unter den mehr als 150 Rhodopsin Mutationen4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), die Klasse II-Mutationen verursachen die strukturelle Instabilität des Proteins Rhodopsin, die zum Stab Photorezeptor Tod beiträgt und Vision Verlust5,6,7,8. Die P23H ist die häufigste Rhodopsin -Mutation in Nordamerika, die auch ein typisches Beispiel für die Klasse II Rhodopsin Mutationen9,10. Aufgrund seiner inhärenten strukturelle Instabilität ist das fehlgefaltete Rhodopsin in das endoplasmatische Retikulum (ER) in Säugerzellen, angesammelt, während der Wildtyp Rhodopsin auf der Plasmamembran5befindet. Das fehlgefaltete Rhodopsin P23H mutierte Exponate dominant negativen Zytotoxizität, die nicht aufgrund von Haploinsufficiency, sondern bezieht sich auf die Aktivierung der ER Protein Degradation Weg und der unterbrochenen Stab äußere Segment Organisation verbunden. Um die Rute Photorezeptor Zelle Stress zu lindern, ist eine Strategie zur Stabilisierung der native Faltung der mutierten Rhodopsin mit pharmakologische Chaperon.
Um dieses Ziel zu erreichen, führten wir eine zellbasierten Hochdurchsatz-Screen (Cloggings)11,12,13 mit einem β-Galaktosidase Fragment Komplementierung Assay, das P23H Rhodopsin mutierte transportiert auf dem Plasma zu quantifizieren Membran. Die robuste und einfache Protokoll des HTS Assays konnten wir die Aktivitäten der rund 79.000 kleine Moleküle für jeden Bildschirm zu erkunden. Weil dieser HTS Assay Lumineszenz Signale liest, sind falsch positive Ergebnisse, einschließlich der β-gal-Hemmer jedoch farbige oder zytotoxische Substanzen in der Trefferliste, die darauf warten, von einem sekundären Assay identifiziert werden enthalten.
Die traditionelle Immunostaining und Fluoreszenz bildgebenden Verfahren wurden jahrelang zur Studie des Rhodopsin-Transports in Säugerzellen5,14,15,16. Jedoch können nicht diese konventionellen Methoden verwendet werden, um die pharmakologische Wirkungen von mehr als 10 Verbindungen in Richtung Rhodopsin Verkehr zu quantifizieren, da eine zuverlässige bildgebende Analyse erfordert eine große Anzahl von Aufnahmen unter einer sehr konsistent Bedingung, die von der konventionellen bildgebenden Verfahren nicht geändert. Hier entwickelten wir eine Immunostaining basierten High-Content imaging Protokoll als eine sekundäre Assay, der Cell Landverkehre fehlgefaltete Rhodopsin Mutanten11,13,17zu quantifizieren. Rhodopsin auf der Plasmamembran beschriften, wir dem Schritt übersprungen Permeabilisierung der Zellmembran und Immunostained die Rhodopsin-Mutanten durch einen monoklonalen (B6-30) Anti-Rhodopsin erkennen die N-terminale Epitop des Rhodopsin auf der extrazellulären Seite der Zelle Membran-18. Um das mutierte Rhodopsin in der ganzen Zelle zu visualisieren, verschmolzen wir Rhodopsin mit dem Venus-Fluoreszenz-Protein. Durch die Quantifizierung der Fluoreszenz-Intensitäten in verschiedenen Fluoreszenz Kanälen sind wir in der Lage, mehrere Parameter von einem einzigen Experiment einschließlich der gesamten Rhodopsin-Intensität in der ganzen Zelle auf der Zelloberfläche und das Verhältnis von zu erhalten Rhodopsin Fluoreszenz auf der Zelloberfläche, die in der ganzen Zelle. Anwendung dieser Methode zu stabilen Zellen insgesamt sechs fehlgefaltete Rhodopsin durch Mutation entstehende Variationen zum Ausdruck zu bringen, können wir eine pharmakologische Profil der mehrere kleine Molekül Chaperone gegenüber diesen Mutanten erzeugen. In diesem Protokoll alle Zellen sind Immunostained in einem 384-Well-Platte und abgebildet, mit einem automatisierten imaging System unter einer sehr konsistent bildgebenden Bedingung. Eine Bildanalyse erfolgt in jede Vertiefung, mit Bildern von mehr als 600 Zellen Variante aufgrund der Heterogenität der Zellen mit unterschiedlichen Zellebene Form und Protein-Expression zu reduzieren. Der Workflow dieses Protokolls ist in Abbildung 1zusammengefasst. Der Vorteil dieser Methode ist, dass wir hochauflösende Bilder sowie Multi-Parameter-Quantifizierungen aus der Image-basierte Analyse erhalten. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll geändert und angewendet, um den Transport fehlgefaltete Membran Proteins des Interesses zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigten wir einen High-Content imaging Assay verwendet für die Charakterisierung von Hits aus einem HTS identifiziert Die einzige Automatisierung dieser Protokolle beteiligt ist der High-Content-Imager. Die Immunostaining und Fluoreszenz-Bildgebung des Rhodopsin haben häufig verwendet, um die Lokalisierung von Rhodopsin5,14,15,16zu charakterisieren. Allerdings ist die Quantifizierung der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Dr. Mark E. Schurdak und University of Pittsburgh Drug Discovery Institute für die Bereitstellung von High-Content Imager und erste Schulungen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) teilten großzügig 1-4 und B630 Anti-Rhodopsin Antikörper. Das Plasmid enthält die cDNA Maus Rhodopsin-Venus Konstrukt wurde von Dr. Nevin Lambert (Augusta Universität) geteilt. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health Grant EY024992 YC und P30EY008098 von der University of Pittsburgh Vision Forschung Core Grant unterstützt.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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