Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

1. Generation ein Plasmid, das drückt die Chimäre konstruieren Hinweis: Ziel ist es, ein Plasmid zu generieren, die drückt die extrazelluläre Domäne des Rezeptors des Interesses zu den transmembranen und intrazellulären Domänen der Maus CD3ζ Kette (Abb. 2A) verschmolzen. Rufen Sie die Reihenfolge der extrazellulären Domäne des Rezeptors von Interesse, einschließlich das Signalpeptid ab. Erhalten Sie DNA-Material, die diesen Rezeptor (z. B. cDNA oder ein Plasmid) zum Ausdruck bringen soll. DNA-Material, das den transmembranen ausdrückt und die intrazellulären Domänen der Maus CD3ζ Kette erhalten (zB., cDNA oder ein Plasmid). Entwerfen Sie die Sequenz des Fusionsproteins basierend auf der allgemeinen Struktur in Abbildung 2Agezeigt. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Sequenz innerhalb der gleichen Codon Leserahmen. Diese Sequenz wird verwendet, um geeignete Primer zu entwerfen und überprüfen das Endprodukt. Design zwei PCR-Reaktionen auf jedes der Fragmente von der Fusionsproteinen separat zu verstärken (Abb. 2 b, 2 C)10.Hinweis: Die spezifischen Bedingungen für die PCR-Reaktionen (z. B.., Dehnung Zeit und Temperatur Glühen) hängen von der Art der Primer, die für einen spezifischen Rezeptor ausgelegt sind. Das extrazelluläre Segment des Rezeptors zu verstärken. Entwerfen Sie eine 5′-Grundierung, die das Signalpeptid des Rezeptors, einer Konsensussequenz Kozak und eine entsprechende Beschränkung Site (Abb. 2 b) gehört. Entwerfen Sie eine 3′-Primer, die beide Teile des Fusionsproteins (Abb. 2 b) Flanken. Beispielsweise kann dieser 3′-Primer für den ersten Entwurf der letzten 20 Basenpaaren des extrazellulären Segments des Rezeptors und die ersten 9 Basenpaare CD3ζ Segment enthalten.Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit zum Hinzufügen einer Einschränkung-Website, der 3′-Primer, da diese Grundierung verwendet wird, um die verschmolzenen Sequenz zu erzeugen, und nicht zur Unterbindung dient. Verstärken Sie das CD3ζ-Segment. Entwerfen Sie eine Grundierung 5′ die Flanken der beiden Teile des Fusionsproteins (Abbildung 2). Beispielsweise kann für den ersten Entwurf der Primer 5′ die letzten 9 Basenpaare der extrazellulären Segment des Rezeptors und die ersten 20 Basenpaaren des Segments CD3ζ enthalten.Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit zum Hinzufügen einer Einschränkung Website, der 5′-Primer, da diese Grundierung verwendet wird, um die verschmolzenen Sequenz zu erzeugen, und nicht zur Unterbindung dient. Entwerfen Sie eine Grundierung 3′ Ende der CD3ζ-Sequenz sowie eine entsprechende Beschränkung Site (Abbildung 2) umfasst. Die Primer-Sequenzen in jedem dieser beiden Reaktionen zu korrigieren, so dass die Anlasstemperatur ähnlich wie bei jedem Paar (beachten Sie das die Grundierung, die Sequenzen der beiden Teile des Fusionsproteins umfasst ist, nur mit einem Teil der Sequenz in jeder Reaktion glüht). Führen Sie eine zusätzliche PCR, in denen eine Mischung aus der PCR-Produkte der ersten beiden Reaktionen wie die DNA-Vorlage mit dem Primer 5′ des Segments extrazelluläre Rezeptor (Schritt 1.4.1.1) und die 3′ des Segments CD3ζ (Schritt 1.4.2.2) (Abb. 2D)10 verwendet wird . Diese Reaktion sollte die verschmolzene Schlusssequenz generieren. Gehen Sie wie gewohnt zum Klonen. Verbinden Sie das Endprodukt PCR zum Ziel Schnitt Vektor (der Ziel-Vektor ist in der Regel pcDNA3, G418 und Ampicillin-Resistenz ausdrückt). Verwandeln Sie zuständigen Bakterien11den aufgespaltenen Vektor. 50 µL der zuständigen Bakterien auf Eis auftauen. Die Bakterien der aufgespaltenen Vektor hinzu und inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Inkubation bei 42 ° C für 45 s. Fügen Sie 200 µL LB ohne Antibiotika. Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln. Samen auf eine LB-Platte mit den entsprechenden Antibiotika (z.B. Ampicillin-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL). Sammeln Sie und wachsen Sie mehrere Bakterienkolonien in 5 mL LB (in 15 mL Tuben). Extrahieren Sie am nächsten Tag Plasmide mit einem Mini-Prep Kit. Die gen-Einlage mit Restriktionsenzymen zu analysieren. Folge die entsprechenden Kolonien und überprüfen Sie die Reihenfolge und den Leserahmen (wie in Schritt 1.3). Verwandeln Sie zuständigen Bakterien11verifizierte Plasmid. 20 µL der zuständigen Bakterien auf Eis auftauen. Die Bakterien 1 µL des Plasmids hinzu und inkubieren Sie für 20 min auf Eis. Inkubation bei 42 ° C für 45 s. Fügen Sie 200 µL LB ohne Antibiotika. Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit kontinuierlichen schütteln. Saatgut auf einem Bakterienwachstum Teller mit den entsprechenden Antibiotika (z.B. Ampicillin-Lösung mit einer Endkonzentration von 0,1 mg/mL). Wachsen Sie am nächsten Tag eine bakterielle Kolonie in einem großen LB-Behälter mit 0,1 mg/mL Ampicillin (~ 250 mL). Durchführen Sie am nächsten Tag Maxi Prep gemäß den spezifischen Anweisungen vom Kit.Hinweis: Für die Elektroporation-Verfahren ist eine große Menge von Plasmid erforderlich, wie unten aufgeführt. 2. die Transfektion von Plasmid, das das chimäres Protein in BW Zellen ausdrückt Hinweis: Verschiedene Methoden können auch zur Transfektion eingesetzt werden (zB., durch Lentivirale Infektion). Führen Sie bevor die Elektroporation Ethanol Ausfällung der DNA wie unten beschrieben. Die nächsten Schritte erfordern sterile Bedingungen. Am Vortag vorbereiten Elektroporation der BW5147 Zellen (“BW”). Platte 10 Platten (10 cm) mit 10 mL von 100.000 BW5147 Zellen/mL (d. h. insgesamt 10 x 106 Zellen) mit RPMI ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 1 % Natrium Pyruvat, 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % Penicillin-Streptomycin (“komplette Mittel”). 100 µg pcDNA3-Plasmid, das Schmelzverfahren Protein in einer 1,5-2 mL Tube ausdrückt und fügen Sie 3 M Natriumacetat bei pH 5,3-5,5 hinzu. Das Volumen der Natriumacetat entsprechen 0,1 (10 %) des Volumens von 100 µg Plasmid; titrieren den pH-Wert des Natriumacetat mit dem pH-Meter durch Zugabe von NaOH oder HCl. Fügen Sie 2,5 Bände von 100 % Ethanol, die Mischung aus dem Plasmid und das Natriumacetat, wie in Schritt 2.2 (2.5 x das Gesamtvolumen des Plasmids und Natrium-Acetat) beschrieben. Inkubation über Nacht bei-20 ° C oder 2 h bei 70 ° C. 2.4. 24 h nach der BW-Zellen überzogen haben, sammeln Sie alle BW Zellen (~ 100 mL) in 2-50 mL-Tuben. Die Zellen für 5 min bei 515 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wieder aussetzen Sie das Pellet aus beiden Rohren in 25 mL RPMI – in einer einzigen 50 mL Tube. Zum Beispiel wieder auszusetzen Sie das Pellet eine Röhre mit 25 mL RPMI – und dann verwenden Sie diese Flüssigkeit, um die Flüssigkeit in der anderen 50 mL Tube neu auszusetzen, so dass insgesamt Pellet aus dem BW-Zellen wieder in 25 mL Medium in einem einzigen Rohr aufgehängt ist.Hinweis: Das Medium sollte ohne Zusätze, da das Serum mit Elektroporation stören könnten. Zentrifugieren Sie die Zellen wieder für 5 min bei 515 X g. Wieder aussetzen Sie das Pellet in 1 mL RPMI, und übertragen Sie den Inhalt auf einem 0,4 cm-Küvetten auf Eis. Zentrifugieren Sie das Plasmid, das Ethanol Niederschlag (Schritt 2.3) für 30 min bei 16.000 x g und 4 ° c unterzogen Einmal waschen Sie, mit 1 mL 70 % igem Ethanol und Zentrifuge für weitere 20 min bei 16.000 x g und 4 ° C (um das Salz zu waschen). Entfernen Sie das Ethanol und die Pellets leicht trocknen lassen (d. h. in ein offenes Rohr in der Gewebekultur-Haube). Wieder aussetzen Sie das Pellet mit 100 µL RPMI-vorher auf 60 ° c erhitzt Die Zellen in der Küvette neu suspendierten Plasmid (Schritt 2.8) hinzu und inkubieren Sie für 5 min auf Eis. Electroporate der Zellen bei 0,23 kV, 250 Rechtsfähigkeit. Dies dauert ca. 4 ms. Übertragen Sie die elektroporiert Zellen auf eine 50 mL-Tube, fügen Sie 50 mL des kompletten Medium und Zentrifuge für 5 min in 515 X g. Verwerfen Sie den Überstand und wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit 50 mL des kompletten Medium. Platte elektroporiert Zellen in Kultur 24-Well-Gerichte (1 mL pro Bohrloch, für eine Gesamtmenge von ~ 50 Brunnen) und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h. Wählen Sie die transfizierten Zellen mit Antibiotika. Nach 48 h fügen Sie 1 mL der kompletten Medium ergänzt mit 10 mg/mL G418 in jede Vertiefung (in diesem Stadium ist das Endvolumen in jedem gut 2 mL und die letztendliche Konzentration an G418 in jedem ist gut 5 mg/mL).Hinweis: Wenn das Plasmid verschiedene Antibiotika-Resistenz enthält, bestimmen Sie die antibiotische Konzentration erforderlich, um die untransfected BW-Zellen vor diesem Schritt zu töten. Alle 48 h sorgfältig entsorgen 1 mL des oberen Bandes von jedem Bohrloch ohne rühren das Medium in den Brunnen (BW Zellen neigen dazu, an der Unterseite des Brunnens werden). Fügen Sie komplette Medium mit 5 mg/mL G418 in jede Vertiefung ergänzt, so dass das Endvolumen in jedem Bohrloch wieder 2 mL ist. Prüfen Sie regelmäßig die Kultur-Platten für das Zellwachstum in alle Wells.Hinweis: Eine Änderung in der Farbe des Mediums zu gelb kann helfen, wachsende Zellen zu identifizieren; am Anfang des Mediums werden jedoch gelb wegen der G418 selbst. Positive Vertiefungen (Brunnen mit wachsenden Zellen) zu identifizieren. Diese Vertiefungen G418 resistent sind und daher Fusionsproteins ausdrücken sollen. Dieser Vorgang dauert in der Regel ca. 3 Wochen. 3. Überprüfung des Ausdrucks der transfizierten Rezeptor in Zellen in der positiven Vertiefungen. Fleck transfected BW-Zellen mit einem spezifischen Antikörper gegen den Rezeptor der transfizierten war. Vergleichen Sie die Expression des Rezeptors durch Durchflusszytometrie zum Ausdruck der Kontrollzellen (untransfected BW-Zellen). Nach Überprüfung von einem oder mehreren Brunnen in Kultur wachsen Zellen sofort für experimentelle Zwecke verwenden oder Einfrieren für zukünftige Anwendungen. Der Ausdruck des transfizierten Rezeptors vor der Ausführung eines neuen Experiments zu überprüfen. Nach ein paar Wochen des Wachstums, die Zellen mit G418 mit einem stabilen Rezeptor-Expression kann G418 aus dem Kulturmedium weggelassen werden. (4) Inkubation der BW transfizierten Zellen mit Ziele Hinweis: Wenn Sie die transfizierten Zellen BW zum ersten Mal verwenden, ist es vorzuziehen, testen sie auf Ziele, die eine bekannte Liganden des Rezeptors von Interesse zum Ausdruck bringen oder auf Platte-gebundenen Antikörper spezifisch gegen den Rezeptor von Interesse (Vernetzung Experimente; siehe unten, Abschnitt 4.2.1.3). Teilen Sie vorzugsweise die BW Zellen 24 h vor dem Experiment (z. B. durch Hinzufügen von 10 mL des kompletten Medium bis 2 mL der Zellen in der Kultur in einer neuen Kultur-Platte 10 cm). Inkubieren Sie transfizierten Zellen BW mit ihren Zielen. Führen Sie das Experiment gleichzeitig auf Kontrollzellen BW, die ein leerer Vektor (oder elterliche BW Zellen) ausdrücken. 96F Platten sind zu bevorzugen (aber 96U Platten können auch verwendet werden). Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung. Alle Zellen in das komplette Medium aussetzen. Bereiten Sie die Ziele. Der Typ des Ziels kann variiert in Abhängigkeit von der Zielsetzung, und Zellen, Zellen, die mit Antikörpern oder Antikörper allein vor inkubiert worden sind. Dieses System diente auch als Ziele5mit Bakterien. Wenn die Ziele Zellen (d. h. Zelllinien) teilen sind, bestrahlen sie bei 6.000 rad vor dem Test. Statt 50.000 von den Zielzellen in einem einzigen Brunnen einer 96 Platte (in einem Volumen von 100 µL). Für Experimente mit Antikörpern und BW-Zellen, die menschliche FcγRs ausdrücken inkubieren der Zielzellen mit einem Antikörper auf dem Eis in einer 96-well-Platte (zum Beispiel, 50 µL der Zielzellen und 50 µL des Antikörpers; verschiedene Antikörper Dosen getestet werden können). Wenn Antikörper allein als Ziele (Vernetzung Experimente) verwenden, sollten sie die Platte gebunden sein. Zu diesem Zweck zunächst inkubieren Sie die Antikörper in einem kompletten Medium in einer 96F Platte für 1-2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 (eine typische Anfangsdosis beträgt 0,5 μg einen spezifischen Antikörper in 50 μL). Waschen Sie die Platte um ungebundenen Antikörper zu entfernen.Hinweis: In diesem Fall wird eine 96F Platte Bindung des Antikörpers an der Platte ermöglichen der nach Zugabe von den transfizierten Zellen BW zur Aktivierung des Rezeptors transfizierten führt. Die BW-Zellen (Effektorzellen) hinzufügen. Platzieren Sie 50.000 BW Zellen in einem einzigen Brunnen einer 96 Platte (in einem Volumen von 100 µL). Füllen Sie die Lautstärke in jede Vertiefung zu 200 µL bei Bedarf. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h (dieser Zeitraum kann kalibriert werden). Nach 48 h, frieren die Platten bei-20 ° C und Tauwetter vor ELISA oder sofort für ELISA (siehe nächsten Schritt). 5. ELISA Mantel einer ELISA-Platte mit einem Anti-Maus-IL-2-Antikörper (anti-mIL-2). Legen Sie 0,05 µg anti-mIL-2 in einem Volumen von 50 µL 1 X PBS pro Bohrloch. Inkubieren Sie die beschichtete ELISA-Platte mit dem anti-mIL-2-Antikörper bei 4 ° C über Nacht oder bei 37 ° C für 2 h.Hinweis: Um ELISA direkt nach der Inkubationsschritt durchzuführen, sollten die ELISA-Platte 24 h vor dem Ende der Inkubationszeit der BW Zellen beschichtet werden. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in der ELISA-Platte und fügen Sie eine blockierende Lösung (200 µL pro Well), bestehend aus 1 X PBS und 1 % Rinderserumalbumin (BSA) ist. Inkubieren Sie die ELISA-Platte für 2 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die ELISA-Platte dreimal mit PBS-Tween Lösung 0,05 % (d. h. 0,5 mL Tween-20 in 1 Liter 1 X PBS). Nehmen Sie die 96 Platte hat die BW-Zellen, die mit ihren Zielen (4.3) inkubiert wurden. Wenn die Platte gefroren war, tauen Sie es komplett (zB. durch kurze Inkubation bei 37 ° C). Zentrifugieren der 96 Platte (5 min, 515 X g) und 100 µL des Überstands in jede Vertiefung sorgfältig auf vorbeschichtete und blockierte ELISA-Platte übertragen.Hinweis: Der Überstand sollten von den Seiten von jedem Bohrloch zu vermeiden, die Zellen gewonnen werden. Falls gewünscht, fügen Sie rekombinante mIL-2 mit definierten Konzentrationen hinzu, eine der leeren Zeilen der beschichteten ELISA-Platte auf eine Standardkurve von mIL-2 zu generieren. Zum Beispiel eine mIL-2 Konzentration von 2.500 Pg/mL ab und dann in jede anschließende Vertiefung um 50 % zu verringern; Fügen Sie keine mIL-2 bis zum letzten gut. Inkubieren Sie die ELISA-Platte bei 4 ° C über Nacht oder bei 37 ° C für 2 h. Waschen Sie die ELISA-Platte viermal mit PBS-Tween. Der ELISA-Platte Biotin-Anti-Maus-IL-2 hinzufügen. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 µg Antikörper in 1 mL 1 X PBS mit 1 % BSA und teilen in 100 µL pro Bohrloch. Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h. Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS-Tween. HRP-konjugierten Streptavidin hinzufügen. Verwenden Sie eine Konzentration von 1 µL Streptavidin in 1 mL PBSX1 mit 1 % BSA und teilen Sie es in 100 µL pro Bohrloch. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren. Waschen Sie die ELISA-Platte sechsmal mit PBS-Tween. 100 µL pro Bohrloch TMB-Substrat-Lösung hinzufügen. Füllen Sie diese Bühne schnell um Unterschiede zwischen den Brunnen wegen Verzögerungen beim TMB hinzufügen zu minimieren. Lesen Sie die ELISA-Platte mit einem ELISA-Platte-Leser bei 650 nm (die Lesung kann wiederholt, wenn das Signal schwach ist).