反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量⁺ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

オーストリア国立動物実験法 (「Tierversuchsgesetz」) に準拠して記載されているすべてメソッド行ったし、オーストリア国家当局によって動物の試用権限が与えられています。 1. 緩衝液調製検体の採取と 注:使用マウスの緊張は、エピトープ解析に依存します。型にバインドされ、MHC マウスで、例えば表される, H-2 Kb c57bl/6 マウスの適切な四量体を選択します。性別と年齢の動物の科学的な質問によって異なります。説明実験のほとんどはここで、実験、すなわち,最初の予防接種の開始時は 6-8 週齢雌マウスを使用します。 準備 FACS バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 1% ウシ胎仔血清 (FCS) + 0.1% アジ化ナトリウム + 2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、FACS 固定バッファー (PBS で 1.5% (v/v) ホルムアルデヒド)。注:両方のバッファーが事前に準備されていることをお勧めします。使用するまで 4 ° C で保存します。 血液: EDTA 被覆管にマウスの尾静脈からマウスあたりの血液の 20 μ L を収集24を前述のよう。注:血液は、,下大静脈クマゼミやレトロな軌道洞など他のルートでも収集できます。ただし、採血法、国立動物実験法と動物の試用版アプリケーションに準拠します。尾静脈からの血のコレクションは、繰り返し少量の血液が必要な研究に最適です。付加的な材料は、補正コントロールと非染め色コントロールに必要です。 脾臓: は、器官を分離し、注射器のプランジャーの助けを借りて、70 nm、40 μ m の細胞のストレーナーを押します。前述の手順 6 の数、赤血球の溶解を実行します。PBS で 1 × 107細胞/ml の濃度を調整します。1 サンプルあたりの 1 x 10 の6セルが必要です。注:常にいくつか模擬接種を含めるまたはネガティブ コントロールとしてベクター免疫動物を制御します。卵白アルブミン (OVA) の-肯定的な制御として四量体、OT 1 マウスからのサンプルが使用されます。無染色を忘れないでくださいと計算で補正コントロール。必要に応じて、実験でさまざまな動物からのサンプルはこのプールがあります。 サンプル コレクションの後直接染色に進みます。 2. 染色セットアップ 各サンプルを 1 つの FACS チューブを準備します。チューブを正しくラベル付けし、各チューブにオルガン懸濁液 (1 x 10 の6セル) の 100 μ L または血の 20 μ L を転送します。 脾臓: 4 ~ 8 ° C で 600 x gで 5 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。渦巻きを細胞ペレットを再懸濁します。注:これは約 20 μ L、血液サンプルのボリュームとして同様の残りのボリュームになります。 各チャネルはまた使用するため補正のサンプルの 1 つの FACS 管を準備します。無染色のコントロールと 1 つの追加のサンプルを準備します。 3. 四量体染色 各サンプルの四量体希釈の 50 μ L を使用します。推奨されるテトラマーおよび最適化された希薄、表 1 を参照してください。注:テトラマーまたは抗体を使用する場合、キャビネット安全性のライトをオフし、光からサンプルを保護します。 FACS バッファー管を準備 (ボリューム = × サンプル数 50 μ L 加え、ピペッティング エラーを補正する総量の 10% の追加)。 表 1に記載されている最適な希釈に tetramer(s) を追加します。渦ソリューション。注:上場 fluorophores が付いている全体の抗体パネル (CD3、CD8、CD43、CD44、CD62L) を使用して、PE と (APC) で 2 つのテトラマーが指定できます。単一染色で両方テトラマーを組み合わせることができますすなわち,は、両方のテトラマーと細胞の染色を同時に実行することができます。 四量体 ペプチッド シーケンス 対立遺伝子 蛍光体 希釈 MHC 私/OVA SIINFEKL H-2 Kb APC 1:25 MHC 私/VSV NP RGYVYQGL H-2 Kb PE 1:25 MHC 私/EGFP HYLSTQSAL H, マウス PE 1:25 MHC 私/脈絡 GP KAVYNFATC H 2 db APC 1:25 MHC 私/HPV 16 E7 RAHYNIVTF H 2 db APC 1:10 表 1: テトラマーと最適な希釈を提案します。(卵白アルブミン (OVA) および強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP)) モデル抗原や病原体コンポーネント (水疱性口内炎ウイルス (VSV) np)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (脈絡のいくつかの主要抗原ペプチドの推奨されるテトラマー) 糖タンパク質 (GP) とヒトパピ ローマ ウイルス (HPV) E7 腫瘍 (E7))。それぞれ、ペプチド配列と対応する対立遺伝子、同様に推奨される蛍光体および最適化された希釈が表示されます。 各サンプルと渦に優しくテトラマー希釈の 50 μ L を追加します。補正コントロールおよび無染色のサンプルのみ (4 量体) なし FACS バッファーを追加します。 光から保護、37 ° C で 20 分間サンプルをインキュベートします。四量体から抗体染色へのシームレスな移行を確保するため、培養時間の間に手順 4 で説明した抗体ミックスを準備します。注:それぞれの個々 の量 (希釈、インキュベーション時間と温度) の最適の条件を調整する必要があります。 4. 抗体の調製 各サンプルの抗体ミックスの 50 μ L を準備します。 FACS バッファー管を準備 (ボリューム × サンプル数 50 μ L 加えピペッティングのエラーを補償するために容量の追加の 10% を =)。 表 2に記載されている希釈に抗体を追加します。注:科学的な質問によってここに記載されているものから離れて他のマーカーの組み合わせをされる可能性があります。常にパネルに CD3 および CD8 抗体を含めることを確認します。 渦ソリューション。 抗体 蛍光体 希釈 μ g/サンプル マーカー CD3 PE Cy7 1: 200 0.05 Ctl (CD3+CD8+) CD8 パシフィック ブルー 1:750 0.013 V450 1: 100 0.1 CD43 FITC 1: 100 0.25 活性化 (CD43+) CD44 PE Cy5 1: 250 0.04 ナイーブ (CD44-CD62L+) & エフェクター (CD44+CD62L-) CD62L APC Cy7 1: 500 0.02 表 2: このプロトコルと最適な希釈で使用される抗体です。推奨表面マーカー (CD3、CD8、CD43、CD44、CD62L) は、最初の列に表示されます。ごとに、推奨される蛍光体、最適化された希釈と抗体/サンプルの量が表示されます。最後の列に各マーカーで識別されるセル型が指定されます。 補正コントロール抗体を準備します。各補償制御それぞれのカラーに CD8 抗体を使用します。 各チャンネルを FACS バッファー 200 μ l チューブを準備し、それぞれのカラーに CD8 抗体希釈 1: 200 の 1 μ L を追加します。 渦管。 すぐに染色に進みます。 5. サンプルの染色 4-8 ° C で 600 x gで FACS バッファーと 5 分間遠心する 〜 1 mL を追加してサンプルを一度洗う遠心分離の後上澄みを廃棄し、ペーパー タオルのスタックの残りの液を切る。注:血で処理する場合は、残りの液体を排水するとき注意が必要。赤血球の溶解前に血は FACS 管の下部に固執しません。また、上清を吸引します。 各細胞ペレットと渦に優しく抗体ミックスの 50 μ L を追加します。 優しく対応する補償制御と渦の細胞ペレットに 50 μ L の各補償のミックスを追加します。 優しく無染色制御と渦の細胞ペレットに FACS バッファーの 50 μ L を追加します。 光から保護、4 ° C で 30 分間すべてのサンプルをインキュベートします。 器官を使用する場合: 手順 6 をスキップします。〜 1-2 を追加することで一度洗って FACS バッファーおよび 4-8 ° C で 600 x gで 5 分間遠心分離機の mL遠心分離の後上澄みを廃棄し、ペーパー タオルのスタックの残りの液を切る。 血液を使用する場合: 6 (赤血球の溶解) の手順に進みます。 6. 赤血球の溶解 各サンプルと優しく渦に ACK (アンモニウム塩化カリウム) バッファー25 500 μ L を追加します。注:ACK バッファーは、浸透圧の腫れと具体的には赤血球の溶解に します。 暗闇の中で部屋の温度で 5 分間インキュベートします。 4-8 ° C で 600 x gで FACS バッファーと 5 分間遠心の 1 mL を追加します。遠心分離の後上澄みを廃棄し、ペーパー タオルのスタックの残りの液を切る。メモ: ペレットが赤ではなく、赤血球の溶解を繰り返します。 〜 1-2 を追加することで一度洗って mL FACS バッファーと 4-8 ° C で 600 x gで 5 分間遠心遠心分離の後上澄みを廃棄し、ペーパー タオルのスタックの残りの液を切る。 7. フローサイト メーターによる測定と解析を流れ 各管に FACS 固定バッファーの 150-300 μ L を加え、ボルテックスで混ぜます。血 20 μ、150 μ L のバッファーで十分です。注:固定の前に細胞が塊の形成を防止するためにも再度中断されたことを確認します。できるだけ早く流れフローサイト メーターによる測定を続行します。 補正コントロールを測定し、任意のスペクトルの重複を修正します。 CD3 の選択を図 1に示すように、シーケンシャル ゲートを設定+/CD8+細胞。 前後脇の散布 (エリア) (非対数スケール) を使用してリンパ球にゲート。 リンパ球の集団内で前方散乱幅対エリア (非対数スケール) を使用して単一セルのゲートします。 CD3 および CD8 チャネル (対数目盛) を使用して 1 つのセルのリンパ球をプロットします。CD8 を識別する+ T 細胞の CD3 ゲート+/CD8+細胞。 CD8 をプロット+対+四量体細胞と CD8 のゲート+テトラマー+セル、図 2に示すように。 可能であれば、CD3 に 20,000 (血から少なくとも 5,000 細胞) を記録+/CD8+の各サンプルのゲートし、FCS ファイルとして保存します。注:記録する細胞の量は興味の抗原特異的細胞の頻度に応じて調整する必要があります。 適切な分析ソフトウェアで FCS ファイルを分析します。(セクション 7.3) 上記のようにゲートの戦略を使用し、CD8 を定量化+テトラマー+細胞。