İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz
Summary
Bu iletişim kuralı, hücre kültür ortamından küçük RNA Kütüphane inşaat ve sonraki nesil sıralama ekstraselüler mikroRNA’lar arındırmak gösterilmiştir. Çeşitli kalite kontrol denetim noktaları ne exRNAs gibi düşük giriş örnekleri ile çalışırken olacağını anlamak okuyucuların izin açıklanmıştır.
Abstract
Hücre dışı ve dolaşımdaki RNA’ların (exRNA) birçok hücre türü vücut tarafından üretilen ve tükürük, plazma, serum, süt ve idrar gibi çok sayıda vücut sıvısı bulunmaktadır. Bu RNA’ların bir alt kümesidir posttranscriptional regülatör – mikroRNA (miRNAs). Belirli hücre tipleri tarafından üretilen miRNAs betimlemek için tüp bebek kültür sistemleri hasat için kullanılabilir ve hücre bir alt grubunu profil exRNAs türetilmiş. Mezenkimal Kök hücre salgılanan faktörler çok sayıda hastalıkları ortadan kaldırılmasına karıştığı ve burada tüp bebek modeli sistemi olarak kullanılır. Bu kağıt toplama işlemi, küçük RNA arınma ve Kütüphane üretimi için sıra ekstraselüler miRNAs açıklanır. ExRNAs kültür ortamından hücresel RNA düşük RNA giriş örnekleri, için en iyi duruma getirilmiş yordamları çağıran kalarak farklı. Bu iletişim kuralı her adım kalite kontrol noktalarında exRNA arıtma ve sıralamanın sırasında gösterilen için kapsamlı bir rehber küçük exRNA sıralama kültür ortamından sağlar.
Introduction
Hücre dışı ve RNA’ların (exRNAs) dolaşan mevcut çeşitli vücut sıvıları ve dirençli doğru RNases1,2. Onların yüksek bereket, istikrar ve rahatlık-in erişilebilirlik tanılama ve prognostik işaretçileri3olarak klinik değerlendirmesi için caziptir. ExRNAs için ulaşım modu dahil hücre dışı veziküller (EVs), (örneğin, yüksek yoğunluklu lipoprotein; lipoproteinler ile dernek HDL) ve Ribonükleoprotein kompleksleri (gibi Argonaute2 kompleksleri ile)4.
ExRNAs bir alt kümesidir yaklaşık 22 kodlamayan RNA’ların, küçük mikroRNA (miRNAs), posttranscriptional gen ekspresyonu düzenleyen nt. Eski miRNAs hücre-hücre iletişim ve hücre homeostazı5Yönetmeliği karıştığı olmuştur. Örneğin, HDL endotel hücre adezyon molekül 1 (ICAM-1) bastırmak için eski-miR-223 sunar ve inflamasyon6. İlginçtir, miR-223 da ekstrasellüler lökosit akciğer kanseri hücreleri, onları bir daha invaziv fenotip7üzerinde almak programlama veziküller tarafından taşınan görülmektedir. Böylece, ex-miRNAs çeşitli vücut sıvıları ve hücre kültür orta transcriptome büyük ölçüde eski miRNA sinyal anlayışımızı geliştirir.
Küçük RNA (küçük RNA seq) sıralama küçük RNA’ların transcriptomics anlamak için kullanılan güçlü bir araçtır. Sadece farklı örnekleri arasında differentially ifade bilinen RNA’ların karşılaştırılabilir ama roman küçük RNA’ların da tespit ve karakterize. Sonuç olarak, farklı koşullar altında differentially ifade miRNAs belirlemek de sağlam bir yöntemdir. Ancak, bir küçük RNA seq engel üzerinden düşük exRNA giriş sıvı serebrospinal sıvı, tükürük, idrar, süt, serum ve kültür medya gibi küçük RNA seq kütüphaneler üreten zor olmasıdır. Illumina TruSeq küçük RNA Kütüphane hazırlık kuralından yaklaşık 1 µg kaliteli toplam RNA’ın gerektirir ve New England Biolabs NEBNext küçük RNA Kütüphane hazırlık ayarla iletişim kuralından 100 ng-1 µg RNA8,9gerektirir. Oftentimes, bu örnekler üzerinden toplam RNA vardır geleneksel UV-VIS Spektrofotometreler için algılama sınırı altında.
EX-miRNAs vücut sıvıları türetilmiş potansiyel olarak iyi prognostik ve tanılama işaretleri vardır. Ancak, fonksiyonel etkilerini incelemek için veya belirli eski miRNAs kökenini belirlemek için hücre kültür sistemleri genellikle bunun yerine kullanılır. Onların EVs miyokard infarktüsü, Alzheimer hastalığı ve Greft versus host hastalığı10dahil olmak üzere birçok hastalığın ortadan kaldırılmasına karıştığı olmuştur çünkü Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Burada, biz eski miRNAs arınma kemik iliği türevi MSCs (BMSCs) ve küçük RNA Kütüphane yapılar, sıralama ve veri analizi (şekil 1) en iyi duruma getirmek için kullanılan belirli adımları göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, biz fark ifade analizleri düşük giriş örneklerinden sağlar exRNAs, sonraki nesil sıralama için bir iletişim kuralı tanımlamak. Belirli bir iletişim kuralı için EV ve exRNA yalıtım yapıştırma miRNA13,14düzeyde ve hatta küçük değişiklikler (yani, ultrasantrifüj adım ya da bir değişiklik rotor tipi) transcriptome etkileyebilir çünkü önemlidir. Böylece, nasıl exRNA izole ne olursa olsun, bu sonuçları karşılaştırmak iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onların teknik destek için iNANO Bay Claus otobüs ve Bayan Rita Rosendahl için minnettarız. Onun ultracentrifuge sık sık bizim kullanımına izin veren Dr. Daniel Otzen sayesinde özel. Bu çalışmada yenilik Fonu Danimarka (kabul Projesi) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
