分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析
Summary
このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs のような低入力サンプルを操作するときに期待するものを理解する読者を許可するように記述されています。
Abstract
細胞外と循環の Rna (exRNA) と体の多くの細胞タイプによって生産されて唾、血漿、血清、牛乳、尿など多数の体液に存在します。これらの Rna の 1 つのサブセットは、転写レギュレータ-マイクロ Rna (Mirna) です。特定の細胞のタイプによって生成される miRNAs の線引き、体外培養システムを収穫する使用ことができます、プロファイル exRNAs が 1 つのセルのサブセットから派生しました。間葉系幹細胞の分泌因子は数多くの疾患を軽減することに関与している、ここでの in vitro モデル システムとして使用されます。本稿では、コレクションのプロセスは、小さな RNA の精製とシーケンス細胞外 miRNAs にライブラリを生成をについて説明します。文化メディアから ExRNAs は細胞 RNA から最適化されたプロシージャの呼び出し、RNA の低入力サンプルをされているによって異なります。このプロトコルは、exRNA の精製とシーケンス中に各段階で品質管理のチェックポイントを示す文化メディアから小さな exRNA シーケンスに包括的なガイドを提供します。
Introduction
細胞外と Rna (exRNAs) を循環、様々 な体液に存在 RNases1,2の方が抵抗力があります。その高い豊富、安定性とアクセシビリティのやすさ3診断と予後マーカーとしての臨床的評価のために魅力的です。ExRNAs のための輸送のモードには細胞小胞 (Ev)、リポタンパク質 (高密度リポタンパク質; などとの関連付けが含まれますHDL) とリボ核蛋白質複合体 (よう Argonaute2 錯体を)4。
ExRNAs のサブセットが小さい非コーディングの Rna 約 22 であるマイクロ Rna (Mirna)、転写後の遺伝子発現を調節する nt。Ex miRNAs は、細胞間コミュニケーションと5セルの恒常性の調節に関与しています。たとえば、HDL は内皮細胞接着分子 1 (ICAM-1) を抑制するために ex ミール 223 を提供および炎症6。興味深いことに、ミール 223 も肺癌細胞より侵襲性の表現型7を取ることをプログラミングする白血球細胞小胞で運ば見られています。したがって、様々 な体液や細胞培養液から ex miRNAs のトランスクリプトーム、ex miRNA がシグナル伝達の私達の理解が向上します。
小さな RNA シーケンス (小さな RNA seq) は、小さな rna トランスクリプトームを理解するための強力なツールです。発現の知られている Rna の中の異なるサンプルを比較できるだけでなく新規低分子 Rna はまた検出し特徴付けられます。その結果、それはまた異なる条件下での発現の Mirna を識別するために堅牢な方法です。しかし、小さな RNA seq のハードルの一つは髄液、唾液、尿、牛乳の血清、培地のような低 exRNA 入力流体から小さな RNA seq ライブラリを生成するの困難です。イルミナから TruSeq 小さな RNA 図書館準備プロトコルは、高品質の総 RNA の約 1 μ g を必要と、ニュー イングランド biolabs 社から NEBNext 小型 RNA ライブラリの準備のセットのプロトコルが RNA8,9の 100 ng 1 μ g を必要とします。多くの場合、これらのサンプルからの総 RNA は従来の紫外可視分光光度計の検出限界以下です。
Ex miRNAs 由来の体液は、潜在的によい予後および診断マーカーです。ただし、機能への影響を研究するためにまたは特定の ex miRNAs の起源を決定するため、細胞培養システムが代わりに使用よくされます。EVs は、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植片対宿主病の10を含む多くの疾患を軽減することに関与しているために、間葉系幹細胞 (MSCs) を盛んに研究されています。ここでは、骨髄由来 Msc (BMSCs) と小さな RNA 図書館の建設、シーケンスとデータ解析 (図 1) を最適化するために使用する特定の手順から ex miRNAs の浄化を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、低入力サンプルから発現解析を可能にする exRNAs の次世代シーケンシングのためのプロトコルについて述べる。でも小さな変化 (すなわち、遠心ステップまたはローターの種類の変更) はトランスクリプトームに影響を与えるために miRNA レベル13,14EV と exRNA の分離のための特定のプロトコルに従うことが重要です。したがって、どのよう?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
その技術支援の稲野に氏クロース バスとさんリタ ローゼンダール タンペレに感謝しております。博士ダニエル Otzen 彼の超遠心機の頻繁な使用を許可するために感謝します。本研究は、技術革新基金デンマーク (召集プロジェクト) によって支えられました。
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
