Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines
Summary
Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.
Abstract
Extracellulaires et circulation RNAs (exRNA) sont produites par plusieurs types de cellules du corps et existent dans nombreux fluides corporels comme la salive, plasma, sérum, lait et l’urine. Un sous-ensemble de ces ARN sont les régulateurs post-transcriptionnel – microARN (miARN). Pour délimiter les miARN produites par les types spécifiques de cellules, systèmes de culture in vitro permet de récolter et profil exRNAs dérivé d’un sous-ensemble de cellules. Les facteurs sécrétés de cellules souches mésenchymateuses sont impliqués pour soulager de nombreuses maladies et est utilisé comme système modèle in vitro ici. Cet article décrit le processus de collecte, de purification de petits ARN et de génération de la bibliothèque de séquence miARN extracellulaire. ExRNAs de milieux de culture diffèrent des ARN cellulaire étant faibles échantillons d’entrée d’ARN, qui prévoit des procédures optimisées. Ce protocole fournit un guide complet à exRNA petite séquence de milieux de culture, montrant les points de contrôle de la qualité à chaque étape au cours de la purification d’exRNA et de séquençage.
Introduction
Extracellulaire et circulant RNAs (exRNAs) sont présents dans divers liquides organiques et sont résistants vers RNases1,2. Leur abondance élevée, la stabilité et la facilité d’accessibilité sont attrayants pour l’évaluation clinique des marqueurs diagnostiques et pronostiques3. Le mode de transport pour exRNAs comprennent les vésicules extracellulaires (EVs), liaison avec les lipoprotéines (tels que les lipoprotéines de haute densité ; HDL) et des complexes ribonucléoprotéiques (comme avec des complexes Argonaute2)4.
Un sous-ensemble d’exRNAs sont les microARN (miARN), qui est de petite taille non codantes ARN d’environ 22 nt qui régulent l’expression génique post-transcriptionnel. Ex-miARN ont été impliqués dans la communication de cellule-cellule et régulation de l’homéostasie cellulaire5. Par exemple, les HDL offre ex-miR-223 aux cellules endothéliales pour réprimer la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) et l’inflammation6. Fait intéressant, miR-223 voit également transportés par des vésicules extracellulaires des leucocytes pour les cellules cancéreuses du poumon, à prendre sur une plus invasive de phénotype7programmation. Ainsi, le transcriptome d’ex-miARN provenant de divers fluides corporels et milieu de culture cellulaire améliorera grandement notre compréhension de la signalisation des ex-miRNA.
Petit ARN séquençage (petits RNA seq) est un outil puissant qui permet de comprendre la transcriptomique de petits ARN. Non seulement on peut comparer différents échantillons parmi RNAs connus différentiellement exprimés, mais nouveaux petits ARN aussi peut être détecté et caractérisé. Par conséquent, c’est aussi une méthode robuste pour identifier des miARN différentiellement exprimés dans des conditions différentes. Cependant, un des obstacles de petits RNA-seq est la difficulté à produire des petites bibliothèques de seq RNA provenant des liquides de basse exRNA d’entrée comme les échantillons de liquide céphalorachidien, salive, urine, lait, sérum et milieux de culture. Le protocole de TruSeq petits ARN bibliothèque Prep de Illumina exige environ 1 µg d’ARN total de haute qualité et le protocole NEBNext petits ARN bibliothèque Prep Set de New England Biolabs 100 ng-1 µg de RNA8,9. Souvent, les ARN total de ces échantillons sont inférieures à la limite de détection pour classiques spectrophotomètres UV-visible.
Ex-miARN dérivés de fluides corporels est potentiellement bons marqueurs pronostiques et diagnostiques. Cependant, afin d’étudier les effets fonctionnels ou de déterminer l’origine des ex-miRNAs spécifiques, systèmes de cultures cellulaires sont souvent utilisés à la place. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été étudiés intensivement car leurs EVs ont été impliqués pour soulager de nombreuses maladies, y compris l’infarctus du myocarde, la maladie d’Alzheimer et maladie du greffon contre hôte10. Ici, nous démontrons la purification des ex-miARN de moelle osseuse MSCs (BMSC) et les étapes spécifiques utilisés pour optimiser la petite construction de bibliothèque de RNA, séquençage et analyse de données (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour l’ordonnancement de production prochaine d’exRNAs qui permet des analyses des échantillons d’entrée faibles expression différentielle. Il est important de respecter un protocole spécifique pour l’isolement EV et exRNA parce que même de petites modifications (l’étape de l’ultracentrifugation ou un changement de type de rotor) peuvent influencer le transcriptome et miRNA niveaux13,14. Ainsi, quelle que soit la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à M. Claus Bus et Mme Rita Rosendahl à iNANO pour leur assistance technique. Merci à Dr Daniel Otzen pour permettre à notre usage fréquent de son ultracentrifugeuse. Cette étude a été financée par le fonds d’Innovation danois (projet MUSTER).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
