De locus coeruleus is een kleine cluster van neuronen betrokken bij allerlei fysiologische processen. Hier beschrijven we een protocol ter voorbereiding van muis hersenen secties voor studies van eiwitten en metalen in deze kern.
De locus coeruleus (LC) is een belangrijke zendmast voor noradrenaline produceren neuronen die moduleren van een aantal fysiologische functies. Structurele of functionele afwijkingen van LC gevolgen voor verschillende hersengebieden, waaronder cortex, hippocampus en kleine hersenen en kunnen bijdragen aan depressie, bipolaire stoornis, angst, evenals ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Deze aandoeningen worden vaak geassocieerd met metalen misbalance, maar de rol van metalen in LC is slechts ten dele begrepen. Morfologische en functionele studies van LC nodig zijn om de menselijke pathologieën en de bijdrage van metalen beter te begrijpen. Muizen zijn een gebruikte experimentele model, maar de muis LC is klein (~0.3 mm doorsnede) en moeilijk om te bepalen voor een niet-deskundige. Hier beschrijven we een stapsgewijze immunohistochemistry-gebaseerd protocol om te lokaliseren van de LC in het muis hersenen. Dopamine-β-hydroxylase (DBH), en anderzijds tyrosine hydroxylase (TH), beide enzymen sterk uitgedrukt in de LC, worden gebruikt als immunohistochemische markeringen in plakjes van de hersenen. Secties grenzend aan LC-bevattende secties bruikbaar zijn voor verdere analyse, met inbegrip van histologie voor morfologische studies, metabole testen, alsook metalen imaging X-ray fluorescentie microscopie (XFM).
De locus coeruleus (LC) is een belangrijk gebied in de hersenstam en een grote site van noradrenaline (NE) productie1. De LC projecties in de hersenen2 naar de cortex, de hippocampus en de kleine hersenen3 stuurt en reguleert belangrijke fysiologische processen, met inbegrip van circadiane ritme4,5, aandacht en geheugen6, benadrukken7, cognitieve processen8en emotie9,10. Dysfunctie van LC heeft betrokken bij neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen11, met inbegrip van Parkinson ziekte12,13,14,14van de ziekte van Alzheimer, depressie15 ,16,17, bipolaire wanorde18,19, en angst20,21,22,23, 24. gezien deze rollen, analyse van LC is cruciaal voor het bestuderen van zijn functie en dysfunctie.
Muizen worden veel gebruikt voor het onderzoek van fysiologische en pathofysiologische processen. Vanwege hun kleine omvang heeft de muis LC een gemiddelde diameter van ~ 300 μm, wat leidt tot problemen lokaliseren van de structuur. Tijdens de hersenen afdelen, kan de LC gemakkelijk worden gemist in een coronale of Sagittaal secties. Beschikbare studies beschrijven identificatie van LC in dieren bieden niet een stapsgewijze protocol dat een niet-deskundige,1,25 volgen kan. Dus, als u wilt bieden begeleiding voor de lokalisatie van LC, beschrijven we een protocol die we ontwikkeld om te zoeken van deze regio in de hersenen van de muis voor verschillende toepassingen (Figuur 1, Figuur 2, , Figuur 3). Het protocol geldt zorgvuldig gecontroleerde hersenen afdelen en immunohistochemische detectie van DBH26,27, of als alternatief TH24, beide enzymen hoogverrijkt in de LC-28. Zodra LC door immunohistochemistry ligt, kunnen aangrenzende hersenen segmenten worden gebruikt voor verdere studies, met inbegrip van morfologische en metabole analyses, evenals metalen imaging studies via Röntgen fluorescentie microscopie (XFM)29. We beschrijven XFM als voorbeeld in dit protocol (Figuur 3).
Goed kunt u het model is een cruciale stap in dit protocol. Omdat we zijn met behulp van anatomische eigenschappen van de dorsale oppervlak van de hersenen te vinden LC (grens tussen het cerebellum en de colliculus inferior), is het belangrijk dat de gedeelten correct zijn uitgelijnd. Dit vereist zorg bij het correct vaststellen van de hersenen naar de muis hersenen slicer matrix. Het is raadzaam snijden ~ 500 μm meer weefsel anterior en posterior naar LC om te voorkomen dat de celkern ontbreekt. De meest voorkomende fo…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Abigael Muchenditsi voor het onderhoud van de kolonie van de muis. Gebruik van de geavanceerde Photon bron bij het Argonne National Laboratory werd gesteund door de Amerikaanse Department of Energy, Office of Science, Office van energie basiswetenschappen, onder contractnummer: DE-AC02-06CH11357. Wij danken Olga Antipova en Dr. Stefan Vogt voor gebruikersondersteuning en assistentie bij de geavanceerde Photon bron. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Health subsidie 2R01GM101502 aan SL.
Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
Microscope | Pascal | LSM 5 | |
Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
Pencil brush | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
T pins | Office Depot | 344615 | |
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 |