Fluorimetric teknikleri Sperm membran değerlendirilmesi için
Summary
Burada, metodolojileri spermatozoan membran bütünlüğü, sperm fertilizasyon yetki ile ilişkili bir hücresel özellik değerlendirmek için mevcut. Biz sperm membran fluorimetric değerlendirilmesi için üç teknikler tarif: eşzamanlı belirli floresan problar, floresans mikroskobu ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi ile boyama. Örnek yöntemleri birleştirerek da sunulmaktadır.
Abstract
Standart spermiograms sperm kalitesini açıklayan çoğunlukla ejakülat hacmi ve konsantrasyonu, hareketliliği ve ilerici hareketliliği ve sperm morfolojisi ve canlılık gibi fizyolojik ve görsel parametreleri temel alır. Ancak, bu değerlendirmeler sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değil. Sperm canlılığı ve döllenme potansiyel bakım membran bütünlüğü ve hücre içi işlevine bağlıdır göz önüne alındığında, bu parametrelerin değerlendirilmesi daha iyi bir tahmin sperm fertilizasyon yeterlilik etkinleştirmek. Burada, floresan mikroskopi veya akış sitometresi analizleri ile birlikte belirli floresan problar kullanarak sperm kalitesini değerlendirmek için üç uygun yöntemleri açıklanmaktadır. Analizleri değerlendirildi plazma membran bütünlüğü (DAPI) 4′, 6-diamidino-2-phenylindole kullanarak ve propidium iyodür (PI), acrosomal membran bütünlüğü floresein isothiocyanate Birleşik kullanarak Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) ve Mitokondrial membran bütünlüğü kullanarak 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1). Bu yöntemler kombinasyonları da sunulmaktadır. Örneğin, V annexin kullanım apoptosis değerlendirilmesi ve apoptotik sperm (apoptotik dizin) oranı hesaplama PI fluorochromes sağlar ile birlikte. Spermatozoon membranlar inceleyerek üzerinde temel alır, bu metodolojileri sperm kalitesinin değerlendirilmesi için çok yararlı olduğuna inanıyoruz.
Introduction
Bütünlük ve sperm membran işlevselliğini sperm canlılığı ve fertilizasyon potansiyeli gösteren faktörlerden birkaçıdır. Plazma zarı böylece hücresel ozmotik denge1bakımı, hücre içi ve hücre dışı bölmeleri arasında bir bariyer görevi görür. Plazma membran bütünlüğü zarar indükler herhangi bir stres homeostazı bozabilir, canlılık ve döllenme kapasite azaltmak ve hücre ölümü artırmak. Örneğin, dondurma sperm canlılığı nedeniyle sıcaklık değişiklikleri ve ozmotik stres2bir sonucu olarak onun plazma zarı zarar azaltır. Biz daha önce gıda kaynaklı kirleticiler pestisit atrazine, onun büyük metaboliti diaminochlorotriazine veya mikotoksin Aflatoksin B1, gibi düşük konsantrasyonlarda boğa sperm açığa sperm canlılığı1,3 azaltır rapor . Bu PI, hasarlı bir plazma zarı içeren hücrelerin DNA bağlar ile birlikte çift iplikçikli DNA DAPI ile etiketleme tarafından tespit edilmiştir.
Füzyon acrosomal enzimler4,5sürümde kaynaklanan örten plazma zarı ve dış acrosome membran acrosome reaksiyon (AR) içerir. Zona pelusida penetrasyon ve daha fazla sperm yumurta6ile birleştirilmesi için önemli olaylar bunlar. Bu nedenle, acrosomal membran bütünlüğü değerlendirilmesi erkek üreme7,8,9ve sperm kalitesini değerlendirmek için yararlı bir parametre kabul ettiğiniz anlamına gelir. Çeşitli floresan teknikler acrosome bütünlüğü, FITC-PNA uygulamasına ait veya FITC-PSA8,10doğrulaması için uygundur. FITC-PSA boyama1,3, kalıpları kullanarak bizim önceki çalışmalarda biz sağlam acrosome doğru tanımları (ı) için sağlanan (II) zarar acrosome membran ve (iii) acrosome tepki gösterdi. Geçerli rapordaki sperm adanmış akış sitometresi kullanarak acrosome durumunu değerlendirmek ve bu floresans mikroskobu kullanarak sonuçları karşılaştırın.
Mitokondri çok fonksiyonlu organelleri, diğer şeyler, ATP sentezi, reaktif oksijen türleri üretim, kalsiyum sinyal ve Apoptozis arasında yer vardır. Fizyolojik işlev bozuklukları, kısırlık, erkek ve kadın da dahil olmak üzere değiştirilmiş mitokondriyal işlev11ile ilişkilidir. Sperm mitokondri midpiece içinde düzenlenir ve sperm hareketliliği12‘ çok önemli bir rol oynamaktadır. İyi yüksek mitokondri zar potansiyel (ΔΨm) yüksek fertilizasyon kapasitesi13ve normal hareket ile ilişkili olduğunu kabul edilir. Buna ek olarak, düşük ΔΨm reaktif oksijen türleri yükseltilmiş bir düzeyiyle ilişkilidir ve döllenme oranı14düşük. Yine de, çeşitli çevresel bileşenleri, örneğin Endokrin bozucular, hücresel stres teşvik ve ΔΨm, hyperpolarization1,3, artan üretim serbest radikallerin ve sonunda geçici bir artış yol, Apoptozis15. Floresan sonda 5, 5′, 6, 6′-tetra-kloro-1, 1′, 3, 3′-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iyodür (JC-1) sağlar örneğin, sperm ΔΨm1,3gıda kaynaklı toksinler etkilerini inceleyerek.
Standart spermiograms fizyolojik ve morfolojik parametreleri temel alınarak, sperm kalitesi tahmin etmek yeterli değildir. Daha doğru yöntemleri sperm kalitesini sağlamak için gereklidir. Burada, sperm membran değerlendirme üzerinde dayalı sperm kalitesini belirlemek için kullanabileceğiniz iki uygun yöntem sağlamak: aynı anda dört kişilik belirli floresan problar ve bizim çalışmalar1,3 ‘ te açıklanan floresans mikroskobu ile boyama ve gelişmiş sperm adanmış akış sitometresi, son zamanlarda kullanılan bizim laboratuvar ve başkaları tarafından zaten kullanılmakta16,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperm fertilizasyon potansiyel çoklu kalitesini yansıtan faktöre bağlıdır. Sperm hücreleri yüksek konsantrasyon ve çok kademeli hareketli sperm hücreleri yüksek oranda yüksek kaliteli sperm kabul olabilir. Yine de, böyle bir değerlendirme dikkate almaz diğer hücresel ve fonksiyonel parametreler. ‘Tezgah üstü’ microcapillary akış sitometresi kullanımı floresan problar, daha önce başkaları tarafından17 gösterilen ve burada (tekniği #3) gösterildiği gibi kullanarak çeş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar “SION” İsrail şirketi Suni tohumlama ve üreme (Hafetz-Haim, İsrail) için onların yardım ve işbirliği ve Bayan Li Na (te teknolojileri, L’Aigle, Fransa) araç kurulum ve eğitim ile ilgili yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid] | Sigma | M1254 | |
| PBS | Sigma | P5493 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Ethanol absolute | Sigma | 64-17-5 | |
| Hemacytometer | Neubauer Germany | hemocytometer | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542 | fluorescent probe |
| PI (propidium iodide ) | Sigma | P4170 | fluorescent probe |
| FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin ) | Sigma | L0770 | fluorescent probe |
| JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide) | ENZOBiochem, New York, NY, USA | ENZ52304 | fluorescent probe |
| Annexin V conjugated to FITC | MACS, Miltenyi Biotec | 130-093-060 | fluorescent probe |
| Annexin V binding buffer 20X stock solution | MACS, Miltenyi Biotec | 130-092-820 | buffer |
| Nikon Eclipse, TE-2000-u | Nikon, Tokyo, Japan | inverted fluorescence microscope | |
| Nis Elements | Nikon, Tokyo, Japan | software | |
| Nikon DXM1200F | Nikon, Tokyo, Japan | digital camera | |
| Guava EasyCyte Plus | IMV Technologies, L'Aigle, France | microcapillary sperm flow cytometer | |
| CytoSoft | Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies | software | |
| Buffered solution for cytometry | IMV Technologies, L'Aigle, France | 023862 | buffer |
| Viability and concentration kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024708 | kit for viability assessment |
| Mitochondrial activity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 024864 | kit for mitochondrial activity assessment |
| Viability & acrosome integrity kit | IMV Technologies, L'Aigle, France | 025293 | kit for acrosome integrity assessment |
| JMP-13 | SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA | software | |
| Bovine sperm | "SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel |
References
- Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality. Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).
- Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence. Toxicology. 393, 42-50 (2018).
- Beltrán, C., et al. Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).
- Breitbart, H. Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).
- Almadaly, E., et al. Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status. Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).
- Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods. Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).
- Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin. Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).
- Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes. Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).
- Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells. Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).
- Eddy, E. M., O’Brien, A. . The spermatozoon. , (1994).
- Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability. Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).
- Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm. Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).
- Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).
- Sellem, E., et al. Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen. Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).
- Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis. Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).
- Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry. Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).
