使用培养的果蝇卵室延时电影对局部细胞和组织尺度的actomyosin动力学的分析

新型成像和软件技术在生命科学中的应用不断发展,对理解生命的基本原则产生了巨大影响。主要挑战之一是动态发育过程的可靠可视化,以及不同组织中的实时成像。组织是器官和身体的一部分,因此,大多数不容易获得成像。因此,已经制定了允许其解剖和体外培养的协议,以便可视化生物事件,充分反映活体内的体内状况。

在过去的几十年里,果蝇卵室的培养和活成像,类似原始器官的类似类似类似动物的结构,极大地促进了对原始器官发育基本原则的理解1。^,2,3.目前,有几种培养协议可用,其使用取决于采集时间、要成像的细胞类型及其可访问性(例如,内生殖系与外体线)4 。

所有这些培养协议中的一个共同特征是需要固定分析的蛋室,这些卵室在液体介质中表现出高收缩活性。卵室的收缩活动主要是由覆盖着一长串连接的卵室5、6、7的肌肉表引起的。因此,为了适当固定幼蛋室,已开发出各种方法,包括用盖片覆盖蛋室6、8、9或柔性毛毯4, ¹⁰或嵌入低熔点甘蔗3,11。这些方法很受欢迎,因为它们还允许对更大的视觉平面进行成像,因为蛋室的圆周表面很细平。

然而,最近,已经表明,年轻的卵室(阶段1-8)围绕其前后轴6旋转,并且这种组织运动是由接近这些年轻卵室^{圆周表面的精细肌苷网络供电的12.}因此,由这种组织细微扁平引起的细胞表面的人工改变可能对产生力的肌苷机械的行为产生负面影响。相反,如果卵室组织不扁平,卵室圆周表面的蛋白质显微成像将因采集平面尺寸减小而变得更加有限。

因此,我们结合Prasad等人9和Celeste Berg 4、10实验室的协议,进一步修改它们,以便在开发的方法中不使用盖玻片/柔性毯子/agarose。果蝇卵室在介质中自由培养,此处介绍的协议仅适用于倒置显微镜。该协议分为两个部分。第一部分侧重于分析在卵室内局部细胞规模(多达15个细胞)的actomyosin信号。在第二部分,我们专注于克服与卵子室自由培养引起的小采集平面相关的限制。在这方面,我们开发了一种基于斐济的新型计算方法,采用半交互式图形用户界面,选择性地提取和展开圆周组织表面的已定义层。之后是一个协议,描述如何在组织规模(即>50细胞)分析肌苷。由于使用经典 z 堆栈投影(图 1)选择性地提取已定义的曲面上皮组织的薄层(图1),这种易于使用的方法是全面了解在果蝇卵室的组织尺度上,一个薄(<1μm)的肌苷网络的行为。

此外,为了方便该协议,我们提供示例延时电影(TlMs)和荧光标记的非肌肉常规肌苷II行为的样本文件(见补充文件3)。肌苷II是一种运动蛋白,代表肌酸机械的活性收缩部分。为了成像肌辛II,我们使用果蝇转基因线,其中包含一个经过修饰的肌素II的调节光链,称为MRLC::GFP(详见材料表)12,13。为了可视化细胞膜,该协议基于商业染料(见材料表)。该协议不仅适用于分析小亚细胞MRLC::GFP^信号12,也适用于±300μM周围的任何类似大小的亚细胞粒子,如使用生命行动::GFP 12、14观测到的亚细胞粒子。

虽然这两种协议都使用体外培养的果蝇卵室呈现,但在优化培养培养培养和取决于可用性时,也可以使用其他组织进行actomyosin信号的采集荧光标记的蛋白质与相应的商业染料,或,例如,mRNA显微注射,以获得瞬态基因表达配置文件。同样,从圆周表面提取薄层的斐济协议可以更普遍地应用于椭圆体和类似器官的组织中。