体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

1. 試薬の準備 反応バッファー 反応バッファーを準備: 0.5 mM TCEP 粉末を溶解して pH 6.7 PBS で TCEP (MW = 286.65 g/mol) PBSstock 溶液、pH 7.4。注: TCEP の存在は、システインを含む野生型タウ蛋白を用いた集計研究を埋めるためです。現在のプロトコルの TCEP は、7.4 から 6.7 に PBS の pH 調整にのみ使用され、任意の酸化還元反応の調節に役割を果たしています。 徹底的にミックスし、滅菌 0.22 μ m 孔サイズ PES 膜フィルターを通じてソリューションをフィルターします。 因数と-80 ° C でストア。 ベンチで解凍し、ご使用前に RT で安定します。 huTau441 (タンパク質の発現と精製のための参照 Apetriらの huTau441 を削除します。24)-80 ° C のフリーザーから。 ベンチに解凍し、室温 (RT) に釣り合います。 気泡を除去するために 20-25 ° C、12,000 × g で 5 分間タンパク質ストック チューブをスピンします。 280 huTau441by 吸収の濃度測定 0.31 mL mg-1cm-1の消散係数を用いた nm Thioflavin T ThT 乾燥粉末の 10 mg を溶解して 500 μ M thioflavin T (ThT) 原液を準備 (MW = 318.86 g/mol) 35 mL 反応バッファー内。 徹底的に、最高速度で 20 秒間 3 回渦をミックスし、滅菌 0.22 μ m 孔サイズ PES 膜フィルターを通じてソリューションをフィルターします。 411 で吸収測定による濃度を決定する 22,000 M-1 cm-1の消散係数を使用して nm と 500 μ M に ThT 濃度を調整。光から保護された常温保存します。新鮮な 2 ヶ月ごとを準備します。 ヘパリン HMW ヘパリン乾燥粉末の 1 mg を溶解することにより新鮮な 55 μ M、ヘパリン溶液を準備 (MW = 17-19 kDa) 室温 1 mL 反応バッファーに 積極的に振るし、渦 2 倍を 5 秒間。 滅菌 0.20 μ m 孔サイズ PES 膜フィルター (注射器) をソリューションをフィルターします。 2 マルチモード マイクロ プレート リーダーで連続モード ThT 凝集アッセイ 注: ThT 色素反応連続モード (自動測定) で huTau441 凝集速度を監視するために追加されます。通常蛍光光度計で反応を続けることができますがで、マニュアル操作性従来のキュベットを使用して測定の頻度が制限し、記録された運動曲線の精度を妥協します。この理由から、自動のマルチモード マイクロ プレート リーダーを使用します。 楽器設定 コンピューターとマルチモード マイクロ プレート リーダーを入れます。10 分間安定装置を可能にします。 ソフトウェアを起動し、プロトコルを準備します。 プロトコルの種類を選択: (データ削減は実行しない独立して各板) の標準プロトコル。 37 ° C に温度を設定し、プロトコルを続行する前に preheatment を選択します。 運動の実行設定: 実行時間 50 h/測定間隔: 15 分。 連続モードで 425 インプレッション (3 mm) で揺れが軌道を設定します。 読み取り方法を選択: 蛍光強度エンドポイント、カイネティック – 分光波長: 励起 440 nm (20 nm 帯域幅)/発光 485 nm (20 nm 帯域幅) – 光学位置: トップ – 通常速度 – を読んで、高さ: 4.50 mm 作成されたプロトコルを使用して実行を開始します。所望の温度を平衡事前に楽器の名前を実験、新しく作成されたファイルの出力先を選択でき 自発的な huTau441 変換 1.5 mL チューブに反作用のサンプルを準備します。反応と少なくとも 4 複製あたり使用 200 μ L ミックス (4 の反作用ボリュームをレプリケート = 800 μ L)。 800 μ L 反応試料 (4 レプリケートします) の場合は 15 μ M huTau441、8 μ M ヘパリンおよび 50 μ M を準備 ThT 反応バッファーにタンパク質を混ぜることによって開始ヘパリンと ThT を追加し、上下に 5 回ピペッティングでよく混ぜます。試薬の追加の示された順序を尊重します。 12,000 × g で気泡を除去するために 5 分の 25 ° C のサンプルをスピンします。 200 μ L/ウェルの 96 ウェル マイクロ プレートで反作用のサンプルの分注 (96 ウェル黒ソリッド マイクロ プレート、よくボリューム 360 μ L、底が平らな)。空気の泡の形成を避けるため。 蒸発を避けるためにプレートをシールします。 マルチモード マイクロ プレート リーダーでマイクロ プレートを置き、測定を開始します。 実験の終了後、機器からプレートを削除してデータ処理ソフトウェアにデータをエクスポートします。 変換、種子コレクションと貯蔵の品質チェック。 プレートからシーラーを削除し、プールを 1.5 mL チューブに異なる複製。それを収集する前に、上下 2 回をピペッティングにより井戸に集約されたサンプルをよく混ぜます。集計は井戸の底に沈殿する傾向があります。 ミックス徹底的 1.5 mL 管の上下に 5 回ピペッティングとマイカ表面 (さらに詳細を見る Apetriらの AFM による集計を分析するために 10-20 μ L を分注24)。 1 時間 20,000 × g と 4 ° C で 1.5 mL チューブを回すことによって、集計を収穫します。集計は、ペレットを形成します。 分離および単量体の tau (さらに詳細を参照 Apetriらの集計に成功した変換を示すサンプルの有無を確認する S MALS で上清を分析24)。 初期 huTau441 の蛋白質の集中そしてサンプル ボリュームを示す残りの集計 (ペレット) を含む 1.5 mL チューブにラベルを付けます。スナップは、凝集体を凍結し、-80 ° C で保存します。 シードの反応 -80 ° C の冷凍庫から huTau441 集計を削除します。反応バッファーのボリューム ラベル (初期サンプル ボリューム) に記載された、8 回に 5 上下ピペッティングにより集計ルートを再懸濁しますに安定管を追加します。 集計サンプルを超音波照射します。200 μ L のサンプル (15 μ M huTau441)、超音波 1/8「陰極を使って氷の上 (100 μ l から 10 mL まで) 15 の全期間のため 1 秒のパルスと 2 の一時停止を使用して s 30% 振幅 (超音波発生装置 250 ワット) で s。右のサンプルを再平衡します。注: 採用超音波処理条件は、20-50 nm24の長さとタウ線維の同質な人口に します。 1.5 mL チューブに反作用のサンプルを準備します。反応と少なくとも 4 複製あたり使用 200 μ L ミックス (4 の反作用ボリュームをレプリケート = 800 μ L)。 15 μ M huTau441、8 μ M ヘパリンおよび 50 μ M を含む 800 μ L 反応サンプルを準備 ThT 反応バッファーにタンパク質を混ぜることによって開始ヘパリンと ThT を追加し、上下に 5 回ピペッティングでよく混ぜます。試薬の追加の示された順序を尊重します。 12,000 × g で気泡を除去するために 5 分の 25 ° C のサンプルをスピンします。 反作用のサンプル (96 ウェル黒ソリッド マイクロ プレート、よくボリューム 360 μ L、底が平らな) の 96 ウェルのウェルあたりの 200 μ L を分注します。空気の泡の形成を避けるため。 (5 回) をピペッティング上下反復をして徹底的に前もって形成された線維サンプルを均質化し、種子の割合に相当する額もそれぞれ追加します。前もって形成されたシード添加の 2 μ L は、200 μ L よく総容積 1% (v/v) です。ミックス ピペッティングを上下 3 回井戸に追加するとき、空気の泡の形成を避けるため。 蒸発を避けるためにプレートをシールします。 マルチモード マイクロ プレート リーダーでマイクロ プレートを置き、測定を開始します。 機器からプレートを削除し、データをスプレッドシートにエクスポートします。