Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme
Summary
Burada adrenal bezlerin fareler üzerinden ayırma, dokuları düzeltmek, onları bölüm ve ayirt boyama gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Ayirt antijenleri dokularda tespiti fluorochrome Birleşik antikorlar istihdam ile köklü bir teknik ve uygulamaları geniş bir yelpazede vardır. Algılama antijenleri karakterizasyonu ve birden çok hücre türü tanımlaması için sağlar. Böbrekler üzerinde bulunan ve mezenkimal hücreler tabakası tarafından Kapsüllü, böbrek üstü bezi endokrin organ farklı Embriyoda kökenleri ile iki farklı dokular, mesonephric ara mesoderm kaynaklı dış korteks ve sinir tarafından oluşan olduğunu iç medulla Crest kaynaklı. Adrenal medulla katekolaminler (Yani, adrenalin, noradrenalin) üretir, ancak adrenal korteks steroidler (Yani, mineralocorticoids, sebepler, cinsiyet hormonları), salgılar. Adrenal araştırma yürütürken, farklı fonksiyonları ile benzersiz hücre ayırt edebilmek önemlidir. Burada bir protokol sağlar bir dizi sıralı adımları böbreküstü bezinin hücre tipleri tanımlamak için ayirt boyama elde etmek için gerekli açıklar bizim laboratuvarda geliştirilmiştir. Biz ilk fare böbreküstü bezlerinin diseksiyon fiksasyon, işleme ve parafin doku gömme takip periadrenal yağ mikroskobik kaldırma odaklanmak. Biz o zaman bir döner microtome ile doku bloklarını kesit tanımlamak. Son olarak, en iyi sinyal sağlamak için non-spesifik antikor bağlama ve autofluorescence en aza indirmek için geliştirdiğimiz böbreküstü bezlerinin immünfloresan boyama için bir protokol ayrıntı.
Introduction
İmmünhistokimya doku bileşenleri belirli hücresel moleküller ve konjuge antikorlar1algılamak için sonraki boyama teknikleri antikor kullanımı ile tespit için bir tekniktir. Bu immunohistokimyasal yordam belirli fiksasyon gerektirir ve spesifik antijen için sık sık ampirik olarak belirlenir dokuların işleme, doku ve antikor kullanılan2. Fiksasyon doku ve böylece sağlam cep ve hücre altı yapıları ve ifade desenleri Bakımı “orijinal” durumunu korumak çok önemlidir. Daha fazla işleme ve yordamlar katıştırma doku immünhistokimya içeren histolojik araştırmalar için kullanılan ince dilimler halinde kesit için hazırlamak için gerekli.
Immunostaining chromogenic veya floresan algılama ile gerçekleştirilebilir. Chromogenic algılama çözünür bir substrat çözünmez bir renkli ürün haline dönüştürmek için sana bir enzim kullanımı gerektirir. Bu enzim (birincil antikor) antijen tanıma antikor Birleşik iken, daha sık birincil antikor (yani, ikincil antikor) tanıma antikor Birleşik. Bu teknik son derece duyarlıdır; enzimatik reaksiyon gelen kaynaklanan renkli ürün photostable ve görüntüleme için sadece aydınlık alan mikroskop gerektirir. Ancak, chromogenic immunostaining devrilmesinden sonra bir renk devrilmesinden sonra diğer bir maske yapabilirsiniz bu yana, ortak yerelleştirmek iki protein görselleştirmek çalışırken uygun olmayabilir. Co boyama söz konusu olduğunda, ayirt daha avantajlı olduğu ispatlanmıştır. Ayirt gelişiyle Albert Coons ve doku antijenleri floresein ile işaretli antikorlar ile tanımlamak ve ultraviyole ışık3altındaki kesitli dokuları onları görselleştirmek için bir sistem geliştiren iş arkadaşları, atfedilir. Floresans algılama uyarma sonra ışık yayan bir fluorophore ile Birleşik bir antikor temel alır. Farklı dalga boylarında, emisyon ile birkaç fluorophores (ile örtüşme) hiç veya çok az olduğundan, bu algılama yöntemi birden çok protein çalışmaları için idealdir.
Böbrek üstü bezi böbrek yer alan ve mezenkimal kapsül tarafından çevrili iki embryologically farklı bileşenleri ile karakterize eşleştirilmiş bir organdır. Süre nöral crest elde edilen iç medulla, adrenalin, noradrenalin ve dopamin gibi katekolaminler üretmek mesonephric ara mesoderm elde edilen dış adrenal korteks steroid hormon salgılıyor. Adrenal korteks farklı sınıflar steroid hormon salgılayan her bölgesi ile üç konsantrik bölgelerde histolojik olarak ve işlevsel olarak ayrılmıştır: elektrolit homeostazı düzenleyen mineralocorticoids dış zona glomerulosa (zG) üretir ve intravasküler hacim; Orta zona fasciculata (zF), doğrudan stres tepkisi plazma glikoz artırmak için enerji depoları seferberlik aracılığıyla arabuluculuk glukokortikoid zG altında salgılar; ve steroid öncüleri (Yani, dehidroepiandrosteron (DHEAS))4sentezler iç zona reticularis (zR), seks.
Adrenokortikal zonation bazı varyasyon türler arasında mevcuttur: Örneğin, Mus musculus zR yoksun. Benzersiz Doğum sonrası X-bölgenin M. musculus acidophilic cytoplasms5küçük lipid-yoksul hücreleri ile karakterize fetal korteks bir kalıntı var. X-bölge ergenlik erkek farelerde ve dişi farelerde ilk gebelik sonrası, kaybolur veya yavaş yavaş değil yetiştirilen kadın6,7‘ dönüştürdü. Organizasyon periferik kök ve progenitör hücre içinde ve zG bitişik olduğu gibi Ayrıca, tortuosity ve zG sergiler kalınlığı türler arasında varyasyon olarak işaretlenmiş. Rat, aksine diğer kemirgen zG ve zF arasında görünür farklılaşmamış bölge (zU) bir kök hücre bölge ve/veya geçici ataları yükseltecek bir bölge olarak bu işlevleri vardır. ZU fareler için benzersiz olan ya da sadece daha belirgin hücre kümesi düzenlenen bilinmeyen8,9‘ dur.
Hücreler adrenal korteksin bütün steroid hormonlar10,11habercisi hizmet kolesterol esterleri depolamak lipid damlacıkları içerir. Terim “steroidogenesis” kolesterol üzerinden bir serisi steroidogenic faktörü 1 (SF1), Ifade steroidogenic potansiyel bir belirtecidir etkinlik dahil enzimatik reaksiyonların steroid hormonlarının üretim süreci tanımlar. Böbreküstü bezinde Sf1 ifade sadece korteks12hücrelerde bulunur. İlginç bir çalışma ile steroidogenic potansiyel13adrenokortikal hücrelerde endojen biotin ifade buldum. Daha yüksek bir arka planda biotin/streptavidin tabanlı boyama yöntemleri, endojen biotin streptavidin ile Birleşik antikor tarafından algılanması nedeniyle nedeni olabileceği gibi bu da bu özelliği aynı zamanda steroidogenic ayırt etmek için istihdam olabilir diğer nüfus böbreküstü bezi, Yani, endotel, kapsül ve medulla hücreleri içinde hücrelerden.
Sempatik pregangliyonik nöronlar tarafından innervated, adrenal medulla bazofilik hücreler tarafından epinefrin ve norepinefrin içeren ayrıntılı bir sitoplazma ile karakterizedir. Medulla hücreleri “kromafin” kahverengi pigment oksidasyon14sonrası formu katekolaminler yüksek içerik nedeniyle adlandırılır. Tirozin hidroksilaz (TH) hızı sınırlaması adım katekolaminler sentez ve böbrek üstü bezi tromboksan, medulla15içinde ifade enzimdir.
Burada fare böbreküstü bezleri, parafin ve kesit ve adrenal bölümlerde oluşturan hücresel türlerini belirlemek için boyama ayirt gerçekleştirmek için bir yöntem içinde katıştırma için onların işlem yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut Adrenal korteks ve medulla. Bu iletişim kuralı laboratuarımızda rutin olarak bizim araştırmada kullanılan birden çok antikorlar ile immunostaining için bir standarttır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı için hazırlık birlikte fare böbreküstü bezlerinin yalıtım ve kesitli parafin gömülü fare adrenal boyama yöntemi açıklanır.
Biz test diğer protokoller için karşılaştırıldığında, bu ayirt Protokolü bizim Laboratuvarda kullanılan antikor çoğunluğu için uygun kanıtlamıştır. Ancak, belirli durumlarda boyama sonuçlarını iyileştirmek için bazı ayarlamalar gerekebilir. Kolayca değiştirilebilir ve test bir fiksasyon uzunluğu değişkendir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Mohamad Zubair onun önerileri ve işyerinde bu protokol teknik yardım için teşekkür ederim. Bu eser diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları, ulusal kurumları Sağlık Araştırma Bursu 2R01-DK062027 (için G.D.H) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
