نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية
Summary
هنا يصف لنا عزل الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج من فبريسوس من الجراب والثقافة والعدوى الخلايا التي تحتوي على فيروس مرض بورسال المعدية، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية.
Abstract
فيروس مرض بورسال المعدية (إيبدف) بيرنافيروس أهمية الاقتصادية لصناعة الدواجن. الفيروس يصيب خلايا ب، مما تسبب في معدلات الاعتلال والوفيات، والكبت المناعي في الطيور المصابة. في هذه الدراسة، يصف لنا عزل الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج من فبريسوس من الجراب والثقافة وعدوى الخلايا مع إيبدف، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية. إضافة الدجاج CD40 يجند زيادة كبيرة في انتشار الخلايا أربعة إضعاف أكثر من ستة أيام للثقافة وبقاء الخلية زيادة كبيرة. الحصول على سلالات اثنين من إيبدف، خلية ثقافة تكييف السلالة و D78 وسلالة خبيثة جداً، UK661، تتكرر أيضا في الثقافات الخلية السابقين فيفو . سيكون هذا النموذج للاستخدام في تحديد كيفية الاستجابة للإصابة إيبدف الخلايا وسوف يسمح بتقليص عدد الطيور المصابة المستخدمة في الدراسات إيبدف المرضية. هذا النموذج يمكن أيضا يمكن توسيعها لتشمل سائر الفيروسات ويمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من الطيور.
Introduction
صناعة الدواجن العالمية أمر ضروري لتأمين ما يكفي من الغذاء السكان بشرية الآخذة في توسع. ومع ذلك، الكبت المناعي هو التهديد للأمن الغذائي ورعاية الطيور المتأثرة ويمثل تحديا اقتصاديا رئيسيا لهذه الصناعة. غالبية حالات الكبت المناعي في الدواجن بسبب العدوى بالفيروسات كآبته، مع أكبر المسؤولين عن إضعاف المناعة المكتسبة بعد انتحاء ل الخلايا اللمفية تي وب1. في الطيور، توجد الأغلبية الخلايا ب داخل هيئة تعرف باسم فبريسوس في بورسا (BF). ب الخلايا معرضة للإصابة بالعديد من الفيروسات المثبطة للمناعة، بما في ذلك تلك التي تسبب تحلل، مثل فيروس مرض إيبدف وفي ماريك (MDV)، وتلك التي تسبب التحول، مثل فيروس إنفلونزا الطيور ليوكوسيس (ALV) و (فيروس ريتيكولوندوثيليوسيس REV).
بغية وضع استراتيجيات أفضل للسيطرة على هذه الأمراض، من الضروري أن تميز تفاعل الفيروسات مع خلايا الدجاج ب. ومع ذلك، عندما تتم إزالة الخلايا ب من الطيور، أنها لا البقاء على قيد الحياة جيدا في السابقين فيفو ثقافة2، مما يجعل من الصعب القيام بتحليل دقيق لتفاعلات إيبدف مع خلايا الدجاج ب، أو أحداث المبكر عقب الإصابة ALV أو القس. ونتيجة لذلك، العديد من التفاعلات الفيروس الخلية المضيفة قد درس في فيفو3،4،5،،من67،،من89، 10. وعلى الرغم من هذه الدراسات مفيدة، أنها تنطوي على استخدام الطيور المصابة التي تعاني من الأمراض التي يمكن أن تكون شديدة.
يجند CD40 هو جزيء أن يستحث انتشار الخليوي ب11. بعد تحديد ترميز الجينات الدجاج CD40L (chCD40L)، تم تصميم بروتين لذوبان انصهار، عند إضافة إلى وسائط الثقافة، التي يسببها انتشار الدجاج الابتدائي ب خلايا السابقين فيفو12. في عام 2015، تم العثور على خلايا ب مثقف في هذا الشكل لدعم النسخ المتماثل MDV2 وفي عام 2017، ونحن وآخرون تبين أن الخلايا بورسال الأولية حفزت مع chCD40L يمكن استخدامها كنموذج لدراسة إيبدف النسخ المتماثل13،14. وهنا يصف لنا العزلة وثقافة الخلايا بورسال الابتدائي الدجاج، وعدوى الخلايا مع إيبدف، والتحديد الكمي للنسخ المتماثل الفيروسية. على الرغم من أن يصف لنا الأسلوب في سياق فرنك بلجيكي، هذا يمكن تطبيقها إلى زنزانات عزل والثقافة من مختلف الأجهزة اللمفاوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وصف ثقافة ناجحة من الدجاج الخلايا الأولية بورسال السابقين فيفو حضور chCD40L القابلة للذوبان، وتبين أن هذه الخلايا يمكن أن تدعم النسخ المتماثل عبئا الموهنة وسلالة خبيثة جداً من إيبدف. يمكن استخدام هذا النموذج السابقين فيفو لتحديد كيفية استجابة الخلايا إيبدف عدوى13، التي لديها مزايا واضحة على الدراسات في الجسم الحي وفي المختبر .
عند الحصاد فرنك بلجيكي، من المهم عدم ثقب الأمعاء لتجنب التلوث البكتيري للخلايا بورسال معزولة. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم أن عزل الخلايا الأولية في أقرب وقت ممكن بعد الحصاد الجهاز للحد من موت الخلايا. الحاجة إلى استخدام chCD40L حد من هذه التقنية؛ ومع ذلك، يظهر العمل الذي اضطلعت به سوبيس et al. أن استخدام phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) لإطالة أمد بقاء الخلية بورسال بدلاً من chCD40L14 قد تمكن النموذج الذي تعتمده أكبر عدد من المختبرات. ويحدد البروتوكول المشار إليها أعلاه تركيز الأمثل chCD40L تجريبيا، باستزراع خلايا ب أولية في تركيزات مخففة متسلسل الجزيء ومراقبة انتشار الخلايا وقدرتها على البقاء. يمكن أن يكون أحد التعديل المحتمل للبروتوكول لتنقية جزيء chCD40L وإضافة تركيز معين إلى خلية ثقافة وسائل الإعلام لتجنب التقلبات دفعة لدفعة.
وقد أظهرت الدراسات في فيفو أن الإصابة إيبدف التالية، هناك زيادة في التعبير عن الجينات المشاركة في الردود سيتوكين برو التحريضية والردود IFN نوع I والمبرمج في BF5،9،10 . ومع ذلك، بعد الإصابة، هناك تدفق الخلايا التحريضية وخلايا المستجيب تي في فرنك بلجيكي، التي تختلف في الجينات وهم يعربون عن مقارنة ب السكان المصابين بخليه9. ولذلك، من الصعب تفسير استجابة الخلايا المصابة كيف إلى إيبدف. ولمعالجة ذلك، اتسمت بعض المجموعات البحثية النسخي استجابة الخلايا المصابة مع إيبدف في الثقافة16،،من1718،،من1920. تتميز هذه الدراسات في المختبر بأشهر المعالم والنقاط الزمنية بوستينفيكشن. ومع ذلك، اتسمت عادة الدراسات في المختبر في الخلايا الجذعية18أو تنتجها الخلايا الليفية الخلايا16،،من1720 . وفي حين لا يمكن أوفيرينتيربريتيد توفير بعض التبصر في التفاعلات إيبدف الخلية المضيفة، الاعتقاد الحالي أن عدوى الخلايا ب أمر حاسم لأمراض ال إيبدف، ومن ثم أهمية البيانات. قبل السابقين فيفو خلية بورسال الثقافة نموذجنا، تميزت دراسة واحدة فقط استجابة الخلايا ب الخلوية ل الإصابة إيبدف19؛ ومع ذلك، تستخدم هذه الدراسة خط مخلدة بخليه التي تحولت بسبب الإصابة مع ALV، يحد من الاستنتاجات التي يمكن أن تقدم. وفي المقابل، يسمح الطراز السابقين فيفو الإصابة إيبدف الموصوفة هنا الباحثين الاحتفاظ بالمزايا في المختبر الدراسات، مثل تعريف أشهر والنقاط الزمنية، أثناء دراسة التفاعلات بين الفيروس مع خلية المضيف ذات الصلة به. كما يتم الحصول على الخلايا بورسال الأولية من المعافين فرنك بلجيكي الأنسجة، هناك لا التهابات أو تي الخلايا الحالية، ونحن قد أثبتت بالتدفق الخلوي (باستخدام الظروف القياسية)، حفز chCD40L التالية، 97 في المائة من السكان خلية إيجابية بالنسبة علامة الخلية ببو-1 (البيانات لا تظهر). وبالنظر إلى أن 3% الخلايا بو-1 السلبية، سوف تكون مثيرة للاهتمام لتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا تصبح مصابة إيبدف واستكشاف التعبير الجيني، ومساهمة لأمراض.
ونحن نتوقع أن نموذج الثقافة الرئيسية الخلية بورسال الدجاج السابقين فيفو يمكن توسيعها أيضا لدراسة التفاعلات المضيف الخلية-فيروس من الفيروسات طردية ب-الخلية الأخرى إصابة الدجاج، مثل ALV أو القس، ويمكن أيضا توسيع نطاق إلى أخرى (أنواع الطيور مثلالبط والديك الرومي). القدرة على ثقافة الخلايا الأولية بورسال السابقين فيفو كما يفتح إمكانية دراسة الجوانب المرضية والكبت المناعي التي تسببها هذه الفيروسات دون الحاجة لتصيب الطيور. دراسات في فيفو يسبب الاعتلال كبيرة، هذا سيكون أثرا كبيرا على استبدال والصقل، والحد من استخدام الحيوانات في البحوث.
وباختصار، السابقين فيفو الدجاج خلية بورسال الأولية الثقافة النموذج الموصوفة هنا لديه إمكانات لتوسيع نطاق فهم كيف إنفلونزا الطيور ب-الخلية فيروسات طردية تتفاعل مع الخلايا المضيفة لها مع تقليل عدد الطيور المستخدمة في فيفو دراسات العدوى. يمكن تطبيق التقنيات متعددة الأجهزة اللمفاوية، فيروسات متعددة، وربما أنواع متعددة من الطيور، مما يجعل من نموذج جذاب التي يمكن أن تسهم في ميادين علم الفيروسات وعلم المناعة إنفلونزا الطيور.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر فريق “الخدمات الحيوانية” في معهد بيربرايت لخبرتهم في تفريخ وتربية وإعدام الطيور وخبرة هولت كارولين في إزالة أسيبتيكالي فبريسوس من الجراب. أتال بيهاري يمول عن طريق التكنولوجيا الحيوية ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (بسرك) عن طريق منح BBS/E/أنا/00001845، ك. د. يمول عن طريق بسرك عن طريق منحة BBS/E/أنا/00002115، ويمول أ. أ. من خلال “المركز الوطني” الاستبدال والصقل والحد من الحيوانات في البحوث (NC3Rs) عن طريق منح NC/R001138/1.
Materials
| RPMI-1640 Medium | Merck | R8758-500ML | |
| FBS | gibco by Life Technologies | 10099-141 | heat-inactivate at 56°C for 1 hour |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter with a PES membrane | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Pierce Protein Concentrator PES (10K MWCO, 20ml) | Thermo Fisher Scientific | 88528 | |
| 0.22µm Millex-GP Syringe Filter | Merck | F7648 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) + CaCl2 + MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14060-040 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS) – CaCl2 – MgCl2 | gibco by Life Technologies | 14180-046 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA) | Merck | 03690-100ML | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) (1 X) + GlutaMAX | gibco by Life Technologies | 31980-030 | |
| Chicken Serum | Merck | C5405-100ML | |
| 2-Mercaptoethanol 50mM | gibco by Life Technologies | 31350-010 | |
| insulin-transferrin-sodium-selenite | gibco by Life Technologies | 41400-045 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics GmbH | 11088882001 | |
| 100µm Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Histopaque-1083 | Merck | 10831-100ML | |
| Trypan Blue solution | Merck | T8154-20ML | |
| Nunc96 Well-Polystyrene Round Bottom Microwell Plates | Thermo Fisher Scientific | 163320 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Sterile | Corning | 353047 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Hoerr, F. J. Clinical aspects of immunosuppression in poultry. Avian Diseases. 54 (1), 2-15 (2010).
- Schermuly, J., et al. In vitro model for lytic replication, latency, and transformation of an oncogenic alphaherpesvirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7279-7284 (2015).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal immunopathology responses of specific-pathogen-free chickens and red jungle fowl infected with very virulent infectious bursal disease virus. Archives of Virology. , (2018).
- Farhanah, M. I., et al. Bursal transcriptome profiling of different inbred chicken lines reveals key differentially expressed genes at 3 days post-infection with very virulent infectious bursal disease virus. Journal of General Virology. 99 (1), 21-35 (2018).
- Guo, X., et al. Differential expression of the Toll-like receptor pathway and related genes of chicken bursa after experimental infection with infectious bursa disease virus. Archives of Virology. 157 (11), 2189-2199 (2012).
- He, X., et al. Differential Regulation of chTLR3 by Infectious Bursal Disease Viruses with Different Virulence. In Vitro and In Vivo. Viral Immunology. 30 (7), 490-499 (2017).
- Ou, C., et al. Transcription profiles of the responses of chicken bursae of Fabricius to IBDV in different timing phases. Virology Journal. 14 (1), 93 (2017).
- Rasoli, M., et al. Differential modulation of immune response and cytokine profiles in the bursae and spleen of chickens infected with very virulent infectious bursal disease virus. BMC Veterinary Research. 11, 75 (2015).
- Ruby, T., et al. Transcriptional profiling reveals a possible role for the timing of the inflammatory response in determining susceptibility to a viral infection. Journal of Virology. 80 (18), 9207-9216 (2006).
- Smith, J., et al. Analysis of the early immune response to infection by infectious bursal disease virus in chickens differing in their resistance to the disease. Journal of Virology. 89 (5), 2469-2482 (2015).
- Tregaskes, C. A., et al. Conservation of biological properties of the CD40 ligand, CD154 in a non-mammalian vertebrate. Developmental & Comparative Immunology. 29 (4), 361-374 (2005).
- Kothlow, S., et al. CD40 ligand supports the long-term maintenance and differentiation of chicken B cells in culture. Developmental & Comparative Immunology. 32 (9), 1015-1026 (2008).
- Dulwich, K. L., et al. Differential gene expression in chicken primary B cells infected ex vivo with attenuated and very virulent strains of infectious bursal disease virus (IBDV). Journal of General Virology. 98 (12), 2918-2930 (2017).
- Soubies, S. M., et al. Propagation and titration of infectious bursal disease virus, including non-cell-culture-adapted strains, using ex vivo-stimulated chicken bursal cells. Avian Pathology. 47 (2), 179-188 (2018).
- Reed, L., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 494-497 (1938).
- Hui, R. K., Leung, F. C. Differential Expression Profile of Chicken Embryo Fibroblast DF-1 Cells Infected with Cell-Adapted Infectious Bursal Disease Virus. PLoS One. 10 (6), e0111771 (2015).
- Li, Y. P., et al. Transcriptional profiles of chicken embryo cell cultures following infection with infectious bursal disease virus. Archives of Virology. 152 (3), 463-478 (2007).
- Lin, J., et al. Genome-wide profiling of chicken dendritic cell response to infectious bursal disease. BMC Genomics. 17 (1), 878 (2016).
- Quan, R., et al. Transcriptional profiles in bursal B-lymphoid DT40 cells infected with very virulent infectious bursal disease virus. Virology Journal. 14 (1), 7 (2017).
- Wong, R. T., et al. Screening of differentially expressed transcripts in infectious bursal disease virus-induced apoptotic chicken embryonic fibroblasts by using cDNA microarrays. Journal of General Virology. 88 (Pt 6), 1785-1796 (2007).
