Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması
Summary
Burada, fare embriyonik kök Southern blot ve/veya PCR kullanarak hücre Homolog rekombinasyon olayları tanımlamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem ile nonmuscle myosin II genetik değiştirme fare modelleri geleneksel embriyonik kök hücre tabanlı Homolog rekombinasyon aracılı hedefleme teknolojisi kullanarak oluşturma tarafından örneklenir.
Abstract
Hedef kapalı etkileri konular ve genom düzenleme, embriyonik kök için tasarımcı nükleaz uygulamasında uzun bir DNA parçası ekleme zorluk göreceli (ES) hücre tabanlı gen hedefleme teknolojisi bu eksiklikleri yok ve yaygın büyük silme/eklemeler tek nükleotid oyuncu değişikliği için değişen hayvan/fare genom değiştirmek için kullanılır. Özellikle, görece az sayıda Homolog rekombinasyon (HR) olayları almak gerekli tanımlama ES klonlar doğru ve güvenilir yöntemler talepleri önemli bir adım isteniyorsa. Güney kurutma ve/veya geleneksel PCR kez bu amaçla kullanılmaktadır. Burada, hangi endojen Myh9 gene bozulur ve diğer nonmuscle myosin ağır zincir (NMHC IIS) IIS kodlama cDNAs tarafından yerini amaçlanmıştır fare ES hücrelerdeki İK olayları tanımlamak için bu iki yöntem kullanarak ayrıntılı yordamlar açıklanmaktadır. Southern Blot tüm prosedürü vector(s), çoğalmasıyla, ilaç seçimi, genişleme ve depolama ES Hücre/klonlar, hazırlık, sindirim hedefleme ve genomik DNA’ın (gDNA), hibridizasyon kurutma inşaat içerir ve probe(s) ve autoradiography son bir adım olarak röntgen filmleri yıkama. PCR doğrudan hazır ve sulandırılmış gDNA ile gerçekleştirilebilir. İdeal sonuçları elde etmek için sonda ve Restriksiyon enzimi (yeniden) Güney kurutma için kesme siteleri ve astar PCR dikkatlice planlanması gerekir. Southern Blot yürütme zaman alıcı ve emek yoğun ve PCR yanlış pozitif sonuçlara rağmen doğru kimlik Southern blot ve PCR tarafından hızlı tarama tarafından açıklanan bu yöntemlerin tek veya kombine uygulama izin yaygın olarak kullanılan ve genotip ES hücre ve genetik olarak tanımlaması içinde çoğu labs tarafından başvurulan için bu kağıt hayvanlar değiştiren.
Introduction
İK tarafından fare ES hücrelerde hedefleme gen teknolojisinin belirli genetik mutasyonlar1,2hücresel sonuçlarını dissekan için güçlü bir araç sağlar. Önem ve bu teknolojinin önemi onun tanıma Týp3,42007 Nobel Ödülü tarafından yansıtılır; Bu arada, gen mühendisliği5modern çağın gelişiyle temsil eder. İK ile hedefleme Gene nokta mutasyonlar büyük kromozomal düzenlemeler fare ES hücreleri6,7için genom içinde değişen hemen hemen herhangi bir değişiklik mühendisi için yararlı olabilir. İyi sözde genom düzenleme araçları ortaya çıkması daha önce bir gen nakavt fare nesil gen hedefleme teknolojisi ES hücreleri8,9,10uygulama gerekli olduğu bilinmektedir. Son iki yılda, 5.000’den fazla gen hedefli fareler insan hastalıkları modelleme veya gen fonksiyonları11eğitim için bu yaklaşım tarafından üretildi. Genom çapında nakavt çaba gen hedefleme vektörel çizimler, hedeflenen ES Hücre klonlar ve bilimsel topluluk2,12,13,14 canlı fareler dağıtmak için kurulmuştur , 15. şüphesiz, ES Hücre tabanlı HR-aracılı gen hedefleme büyük ölçüde anlayışımız fizyolojik veya patolojik bağlamda oynadı genlerin fonksiyonları gelişmiş bir teknoloji.
Çünkü İK memeli nispeten nadir bir olay16,17, önemli hücreleri ve sonraki takip adım gen fare ES hücrelerde çok sayıda ES koloniler meydana gelen mutasyonlar ile birkaç klonlar tanımlamak için analiz etmek için hedefliyor İK ile hedefleme vektör18. İK olayları tanımlamada altın yöntemleri Southern blot ve PCR19,20içerir. Southern Blot doğru hedeflenmiş ES klonlar belirleyebilir ve araştırmacılar inşa etmek, bir tek kopya ekleme bir doğrulama gibi gene hedefli olay yapısını analiz sağlar yaklaşımlar avantajları şunlardır iken bir PCR tabanlı strateji daha hızlı tarama İK olaylar21,22için izin verir. Bu yöntemlerin dezavantajları, gibi olsa onlar zaman alıcı ve var yanlış pozitif, onları kombinasyon kullanımı yaygın olarak kabul ve İK olaylar belirlenmesinde en labs tarafından uygulanan olduğunu, özellikle ES hücrelerdeki genetik olarak oluşturmak için modifiye hayvanlar.
Memelilerde, her üç farklı genler (adlandırılmış Myh9, Myh10 ve Myh14) ve hafif zincirleri, iki çift tarafından kodlanmış iki özdeş NMHC IIS oluşan nonmuscle myosin II (NM II) üç izoformlarının NM II-A, II-B ve II-C23adlandırılır. Önceki çalışmalarda en az bu belirtilmiştir var olduğundan bu izoformlarının in vivo ablasyon embriyonik ölümcül24,25,26‘ NM II-A ve II-B izoformlarının fare gelişimi için gereklidir. Bu sorunu aşmak ve Roman yorumlara izoformu özgü işlevleri NM II-A ve II-B içine fare geliştirme, genetik yerine daha sonraki aşamalarında edinmek için ES Hücre tabanlı HR-aracılı gen hedefleme teknolojisi kullanarak stratejisi için kabul edilmiştir fare modelleri27bir dizi oluşturur. Sırasında istenen ES klonlar belirlenmesi, Southern blot ve PCR yöntemleri kullanılmıştır ve bunlar verimli ve güvenilir27,28olduğu ortaya çıktı.
Bu kağıt Southern blot ve PCR, vector(s), probe(s) ve astar ve deneyler yürütülmesini yanı sıra İK olay tespit ederek örneği sonuçları analiz hedefleme tasarım dahil olmak üzere ayrıntılı bir açıklama sağlamak niyetinde olay ES hücrelerdeki genetik değiştirme NM II fare modelleri ve temsilcisi veri oluşturmak için. Burada sunulan bu iki yöntem protokollerin de genotip genetiği değiştirilmiş hücreler veya hayvanlar belirlemek için kabul edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şu anda, genom düzenlemek için tasarımcı nükleaz hala ES Hücre tabanlı gen hedefleme teknolojisi onun sorunları hedef kapalı efektleri ve uzun bir DNA parçası30,31ekleme zorluk nedeniyle yerini alamaz. Fare ES hücrelerde İK olayları tanımlamak için altın yöntemleri, bu raporu alan Southern blot ve PCR detaylı bir protokol sağlar. Biz bu yöntemler güvenilirliğini yapıları bir dizi hedef fare ES hücrelerden bireysel klonlar analiz ederek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser destek genel programın Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (hibe No. 31571432), insan il doğal Bilim Vakfı Çin (Grant No. 2015JC3097) ve Araştırma Vakfı Eğitim Bürosu, Hunan aldı. Province, Çin (Grant No 15 K 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
