تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل
Summary
نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتحديد الأحداث جزئ المتجانسة التي وقعت في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبية و/أو PCR. ويتجلى هذا الأسلوب توليد نونموسكلي الميوسين الثانية استبدال الوراثية الماوس النماذج باستخدام الجنينية يستند إلى الخلية الجذعية المتجانسة اقترانها بوساطة تستهدف التكنولوجيا التقليدية.
Abstract
بالنسبة للمسائل المتعلقة بالآثار خارج الهدف وصعوبة إدراج جزء الحمض النووي طويلة في تطبيق nucleases المصمم للجينوم الجذعية الجنينية، وتحرير (ES) يستند إلى الخلية استهداف الجين التكنولوجيا ليس لديها أوجه القصور هذه وعلى نطاق واسع يستخدم لتعديل جينوم الحيوان/الماوس بدءاً من الحذف/الملاحق الكبيرة لاستبدال النوكليوتيدات واحدة. جدير بالذكر أن تعريف الأحداث جزئ المتجانسة (HR) قليلة نسبيا اللازمة للحصول على المطلوب استنساخ ES هو خطوة رئيسية التي تتطلب أساليب دقيقة وموثوق بها. النشاف الجنوبية و/أو PCR التقليدية غالباً ما تستخدم لهذا الغرض. هنا، يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لاستخدام تلك الأساليب اثنين لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا التي يراد الجين Myh9 الذاتية أن تعطل والاستعاضة عنها بترميز أخرى نونموسكلي الميوسين سلسلة ثقيلة IIs (NMHC IIs) كدناس. يتضمن الإجراء بأكمله من النشاف جنوب بناء استهداف vector(s) انهانسر، التحديد المخدرات، والتوسع وتخزين خلايا ES/الحيوانات المستنسخة، وإعداد، والهضم، والنشاف للحمض النووي (جدنا)، التهجين و غسالة من probe(s)، وخطوة أخيرة من أوتوراديوجرافي على أفلام الأشعة السينية. يمكن أن يؤديها بكر مباشرة مع جدنا استعداد والمخفف. للحصول على نتائج مثالية، ينبغي بدقة التخطيط المسابير وإنزيم التقييد (إعادة) مواقع قطع النشاف الجنوبي والإشعال لبكر. على الرغم من تنفيذ النشاف الجنوبية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة ولها نتائج PCR المغلوطة، التعرف الصحيح النشاف الجنوبي والفحص السريع ببكر يسمح بتطبيق هذه الأساليب الموصوفة وحدها أو مجتمعة وفي هذه الورقة استخدامها على نطاق واسع واستشارها معظم المعامل في التعرف على الأنماط الجينية لخلايا ES ووراثيا تعديل الحيوانات.
Introduction
تكنولوجيا الجينات استهداف الموارد البشرية في موريني دإط الخلايا يوفر أداة قوية لتشريح الخلوية عواقب الطفرات الوراثية المحددة1،2. أهمية ومغزى هذه التكنولوجيا تنعكس في اعترافها بعام 2007 جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا3،4؛ وفي الوقت نفسه، وهو يمثل قدوم العصر الحديث ل هندسة الجينات5. يمكن أن تستخدم الجينات تستهدف من خلال الموارد البشرية مهندس تقريبا أي تغيير تتراوح بين الطفرات الكبيرة ترتيبات جديدة كروموسومية في الجينوم من الماوس دإط الخلايا6،7. من المعروف أن توليد ماوس خروج المغلوب الجينات المطلوبة قبل ظهور أدوات تحرير ما يسمى الجينوم، تطبيق التكنولوجيا استهداف الجين في دإط الخلايا8،9،10. خلال العقدين الماضيين، تم إنتاج 5,000 أكثر من استهداف جينات الفئران بهذا النهج لنمذجة الأمراض البشرية أو دراسة وظائف الجينات11. وأنشئت بجهد على نطاق الجينوم بالضربة قاضية لتوزيع ناقلات استهداف الجين واستنساخ الخلايا ES المستهدفة، والفئران الحية إلى المجتمع العلمي2،12،،من1314 , 15-مما لا شك فيه، وفاق يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا كثيرا المتقدمة فهمنا لوظائف المورثات لعبت في سياق الفسيولوجية أو المرضية.
نظراً لأن الموارد البشرية هي حدث نادر نسبيا في الثدييات خلايا16،17، الهامة، والخطوة التالية بعد استهداف الجينات في خلايا ES مورين تحليل العديد من المستعمرات ES لتحديد عدد قليل من الحيوانات المستنسخة مع الطفرات الناتجة عن الموارد البشرية مع استهداف ناقلات18. وتشمل أساليب الذهب لتحديد الموارد البشرية الأحداث النشاف الجنوبي وبكر19،20. تشمل مزايا النهج أن النشاف جنوب يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة ES مستهدفة بشكل صحيح، ويسمح للباحثين تحليل بنية الحدث الجينات المستهدفة، مثل قق إدراج نسخة واحدة من البناء، في حين استراتيجية تقوم على بكر يسمح بالفحص السريع للموارد البشرية أحداث21،22. على الرغم من أن هذه الأساليب قد عيوب، مثل أن فمضيعة للوقت ويمكن أن يكون المغلوطة، استخدام التوافيقيه منهم على نطاق واسع المقبولة وتطبقها معظم المعامل في تحديد أحداث الموارد البشرية، خاصة في دإط الخلايا، لتوليد وراثيا تعديل الحيوانات.
إيسوفورمس ثلاثة من الميوسين نونموسكلي “شمال البحر الأبيض المتوسط” (الثانية) في الثدييات، ويتألف كل منهما من اثنين متطابقة NMHC IIs التي تم ترميزها بثلاثة جينات مختلفة (المسماة Myh9 و Myh10 و Myh14) واثنين من أزواج من سلاسل خفيفة، يشار إلى شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء وثانيا-ج23. دراسات سابقة قد أشارت إلى أن على الأقل إيسوفورمس شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-ب ضرورية للتنمية الماوس لأن الاجتثاث في فيفو من isoforms هذه النتائج في الفتك الجنينية24،،من2526. للتحايل على هذه المشكلة والحصول على رواية ثاقبة وظائف محددة isoform شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء في مراحل لاحقة من الماوس التنمية، بديل وراثية اعتمد استراتيجية استخدام ES يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا إلى إنشاء سلسلة من نماذج الماوس27. أثناء تحديد المستنسخين ES المرجوة، استخدمت النشاف الجنوبي وطرق PCR، وهذه أثبتت أنها فعالة وموثوق بها27،28.
وتعتزم هذه الورقة تقديم وصف مفصل لجنوب النشاف وبكر، بما في ذلك تصميم استهداف vector(s)، probe(s)، والإشعال، وتنفيذ التجارب، وكذلك تحليل النتائج يتجلى في تحديد الحدث الموارد البشرية التواجد في خلايا ES لتهيئة الماوس “الثاني شمال البحر الأبيض المتوسط” الوراثية استبدال نماذج وبيانات تمثيلية. ويمكن أيضا اعتماد بروتوكولات هاتين الطريقتين المقدمة هنا للتعرف الأنماط الجينية للخلايا المحورة وراثيا أو الحيوانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
حاليا، نوكليسيس مصمم للتحرير الجينوم لا تزال لا يمكن استبدال ES خلية التكنولوجيا القائمة على استهداف الجين بسبب قضايا لها آثار خارج الهدف، وصعوبة في إدراج الحمض النووي جزء30،طويلة31. ويقدم هذا التقرير كأساليب الذهبي لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وتلقى الدعم من البرنامج العام لمؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (منح رقم 31571432) والبشرية المقاطعة العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (رقم المنحة 2015JC3097) ومؤسسة البحوث للتعليم المكتب هونان مقاطعة بالصين (ك منحة رقم 15 054).
Materials
| BAC CLONE | BACPAC Resources Center (BPRC) | bMQ-330E21 | |
| QIAGEN Large-Construct Kit | QIAGEN | 12462 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit | QIAGEN | 12963 | |
| PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase | Agilent | 600382 | |
| T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Nuclei Lysis Solution | Promega | A7941 | |
| Protein Precipitation Solution | Promega | A7951 | |
| DNA Denaturing Solution | VWR | 351-013-131 | |
| DNA Neutralizing Solution | VWR | 351-014-131 | |
| Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP) | VWR | 27-9240-01 | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher | 15557036 | |
| UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Thermo Fisher | 15593031 | |
| G418 | Thermo Fisher | 10131035 | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Thermo Fisher | 15632011 | |
| Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher | 11304029 | |
| Not I | Thermo Scientific | ER0592 | |
| Dra I | Thermo Scientific | ER0221 | |
| EcoR I | Thermo Scientific | ER0271 | |
| Ganciclovir | Sigma | G2536 | |
| Whatman TurboBlotter Transfer System, Large Kits | Fisher Scientific | 09-301-188 | |
| [α32P]dCTP | PerkinElmer | NEG013H100UC | |
| ProbeQuan G-50 Micro Columns | GE Healthcare | 28-9034-08 | |
| Hybrisol I Hybridization Solution | Millipore | S4040 | |
| Kodak X-Ray Film | Z&Z Medical | 844 5702 |
References
- Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
- Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
- Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
- Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
- Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
- Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
- Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
- Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
- Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
- Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
- Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
- Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
- Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
- Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
- Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
- Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
- Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
- Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
- Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
- Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
- Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
- Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
- Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
- Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
- Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
- Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
- Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
- Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
- Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).
