リアルタイム イメージングと二相循環フロー システムを用いた菌バイオ フィルム開発の定量
Summary
アセンブリ操作について述べる、流下しながらリアルタイムで画像菌バイオ フィルム形成に設計フロー装置のクリーニングします。我々 はまた、提供し、取得した画像に使用する定量的アルゴリズムを話し合います。
Abstract
口腔咽頭カンジダ症は、カンジダ属のメンバーする必要がありますに付着し、唾液の影響下で口腔粘膜表面上に成長します。流れ下で成長のためのモデルを開発しているが、これらのシステムの多くは高価で、またはセルが流下しながら画像を許可しません。成長とカンジダ細胞の流れの下で、リアルタイムでの発展をイメージすることができます新しい装置を開発しました。ここでは、アセンブリと、この装置の使用だけでなく、生成されるデータの定量化のプロトコルを詳しく説明します。セルにアタッチとデタッチ スライドからも時間をかけてスライド上のバイオマスの測定を確認するに料金を定量化することが。このシステムは経済的で汎用性の高い、安価な卓上顕微鏡を含む光の顕微鏡の多くの種類を扱う、他フロー システムに比べて倍のイメージングができる拡張します。全体的にみて、流動場下における真菌種のバイオ フィルムの成長に非常に詳細なリアルタイムの情報を提供することができます低スループット システムです。
Introduction
カンジダ ・ アルビカンス(C. albicans) は、口腔粘膜の表面、口腔咽頭カンジダ症の原因、影響を受けた個人1生命の低品質の結果など、多くの組織タイプに感染する人間の日和見病原菌です。C. アルビカンスの病因の重要な特徴であり、形成とC. albicansバイオ フィルム2,3,4の機能に関する多くの研究が行われているバイオ フィルム形成 5、体外静的 (ない流れ) を使用して多くを行ったモデル。ただし、 C. albicans必要がある、口腔内の唾液の存在下で成長します。多数のフロー システムは、生細胞イメージング6,7,8,9,10を許可するように開発されています。これらの異なった流れシステムは異なる目的のために設計されている、従って各システムに異なる長所と短所。C. albicansの適切なシステムの流れの多くは高価でした、必要な複雑な加工、または流れの中のイメージを作成およびできなかった画像の前に停止しなければならなかったことがわかった。そこで、流れ11下C. albicansのバイオ フィルム形成を研究する新しいフロー装置。私たちフロー装置の設計時にこれらの主要な考慮事項に従いました。まず、バイオ フィルムの成長と開発の複数の側面を定量化することができるしたい (ように私たち研究変異株と変更されていない臨床分離株簡単に) 蛍光セルの使用を必要とすることがなく、リアルタイム。第二に、すべてのパーツを少し変更なしで市販したい (すなわち。、ないカスタム作製)、他よりは簡単に私たちのシステムを再作成できるように、簡単な修理を可能にします。拡張のための許可したいもの第三に、合理的に高流量時の画像します。最後に、たい、流れ、下基板に取り付けるセルの期間に続く新しい細胞を導入することがなく長期間バイオ フィルムの成長を監視することができます。
これらの考慮事項は、図 1に示す 2 フラスコ循環フロー システムを開発する私たちを率いてください。2 つのフラスコでは、2 つのフェーズ、添付ファイルのセル シード フラスコから描画する添付ファイル相、新しいセルを追加することがなくバイオ フィルムの成長を継続する無細胞系メディアを使用する成長期に実験を分割させてください。このシステムは、スライドとチューブ (5 に 2図 1) が、孵化器の中に置かれていることの前の顕微鏡用培養室で動作するように設計されています、外大セカンダリ コンテナーに配置するその他のコンポーネントはすべて、顕微鏡。また、接続された温度プローブとホット プレート攪拌 37 ° C で添付ファイル フラスコの真菌細胞を維持するために使用されます。それは再循環、このシステム フロー (36 h 以上の条件に応じてすることができます)、中に連続的なイメージングが可能です、直立または反転卓上顕微鏡を含む最も標準的な顕微鏡に使用できます。ここでは、アセンブリの操作、しフロー装置のクリーニング同様としては実験後、ビデオを分析するいくつかの基本的な ImageJ 定量的アルゴリズムを提供.
Protocol
Representative Results
Discussion
上記できますフロー システムを使用して菌のバイオ フィルムの成長と発展の定量的な時間経過のビデオを生成。実験間の比較を可能にするイメージングのパラメーターが同じに保たれることを確保するため非常に重要です。これは (多くのガイドは、利用可能なオンラインこのプロセス) 各実験用ケーラー照明が顕微鏡に設定されていることを確認含まれています。パラメーターをイメージ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、フロー装置の設計の貴重な入力を提供するため博士ウェイド Sigurdson を認めたいと思います。
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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