Microdialysis van Excitatory aminozuren tijdens EEG opnames in vrij bewegende ratten

Als u wilt bieden inzicht in de functionele aantasting van glutamaat-gemedieerde excitatory en remmende transmissie GABAergic resulterend in spontane aanvallen in de temporale kwab epilepsie (TLE), we systematisch worden gecontroleerd extracellulair concentraties van GABA¹ en later de niveaus van glutamaat en aspartaat² door microdialysis in de ventrale hippocampus van ratten op verschillende tijdstippen van de natuurlijke ziekte cursus, dat wil zeggen, tijdens de ontwikkeling en de vooruitgang van epilepsie. We profiteerde van de TLE pilocarpine model bij ratten, die de ziekte zeer nauwkeurig op het gebied van gedrags-, elektrofysiologische en histopathologische veranderingen^{3,4 bootst} en wij de dialysate concentratie van amino gecorreleerd zuren zijn verschillende fasen: de acute fase na de epileptogene belediging, de latentie fase, het moment van de eerste spontane inbeslagneming en de chronische phass^5,6,7. Framing van de fasen van de ziekte werd ingeschakeld door op lange termijn video-EEG toezicht en de precieze EEG en klinische karakterisering van spontane aanvallen. Toepassing van de techniek van de microdialysis in verband met langdurige video-EEG toezicht stond ons voor te stellen van mechanistische hypothesen voor TLE Neuropathologie. Kortom, de techniek beschreven in dit manuscript maakt het mogelijk de koppeling van neurochemical wijzigingen binnen een gedefinieerde hersenen gebied met de ontwikkeling en de progressie van epilepsie in een dierlijk model.

Gepaarde apparaten, samengesteld uit een diepte-elektrode heb geplaatst naar een canule microdialysis zijn vaak werkzaam in epilepsie onderzoeken waar veranderingen in neurotransmitters, hun metabolieten of energie substraten moeten worden gecorreleerd aan Neuronale activiteit. In de overgrote meerderheid van de gevallen, het wordt gebruikt in de dieren vrij te gedragen, maar het kan ook op een vergelijkbare manier mensenhandel, bijvoorbeeldin farmaco-resistente epileptische patiënten die een diepgaand onderzoek van de elektrode voorafgaand aan chirurgie⁸kunnen worden uitgevoerd. Zowel EEG opname en dialysate collectie kan afzonderlijk worden uitgevoerd (bijvoorbeeldhet implanteren van de elektrode in een halfrond en de microdialysis sonde in het andere halfrond of zelfs de microdialysis uitvoeren in één groep van dieren tijdens het uitvoeren van de enige EEG in een andere groep van dieren). Koppelen van de elektroden aan sondes echter wellicht meerdere voordelen: het vereenvoudigt stereotaxic chirurgie, beperkt weefselschade slechts één halfrond (terwijl anderzijds, intact, als een besturingselement voor histologisch onderzoek), en de resultaten als dit homogenizes zijn verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen en hetzelfde dier.

Aan de andere kant, vereist de voorbereiding van de gekoppelde microdialysis sonde-elektrode apparaat vaardigheden en tijd als het zelfgemaakte. Men kan relatief hoge hoeveelheden geld uitgeven als gekocht uit de markt. Bovendien, wanneer microdialysis sondes (sonde tips zijn meestal 200-400 µm in diameter en 7-12 mm lang)⁹en EEG elektroden (elektrode tips zijn meestal van 300-500 µm in diameter, en lang genoeg om te bereiken de hersenstructuur van belang¹⁰) zijn het gemonteerde apparaat gekoppeld, en vertegenwoordigt een omvangrijk en relatief zwaar object aan één zijde van het hoofd, dat is lastig voor de dieren en gevoelig te worden verloren, met name wanneer deze is aangesloten op de pomp van de dialyse en de harde-draads EEG opnamesysteem. Dit aspect is meer relevant in epileptische dieren die zijn moeilijk te behandelen en minder aanpassen aan de microdialysis-sessies. Juiste chirurgische technieken en de juiste post-operatieve zorg kunnen resulteren in langdurige implantaten die minimale dier ongemak veroorzaken en moeten worden gestreefd naar voor combinatorische microdialysis-EEG^10,11, experimenten ¹².

De voordelen en beperkingen van de techniek van de microdialysis zijn in detail onderzocht door vele neurowetenschappers. Het primaire voordeel ten opzichte van andere in vivo perfusie technieken (bijvoorbeeld, snelle stroom push-pull of corticale cup perfusie) is een kleine diameter van de sonde die een betrekkelijk nauwkeurige van belang^{13,14oppervlakte, 15}. Ten tweede, het microdialysis-membraan creëert een fysieke barrière tussen het weefsel en het perfusaat; Daarom, hoog-moleculair gewicht stoffen niet doen oversteken en interfereert niet met de analyse^16,17. Bovendien, het weefsel is beschermd tegen de turbulente stroming van het perfusaat¹⁸. Een ander belangrijk voordeel is de mogelijkheid om te wijzigen de perfusaat stroom voor het maximaliseren van de concentratie van de analyt in het perfusaat (dat wil zeggen, het proces van microdialysis kan wiskundig goed worden gedefinieerd en kan worden aangepast voor hoog rendement concentraties van de analyt in het monster)¹⁹. Tenslotte kan de techniek gebruikt worden om de infusie van de drugs of de farmacologisch werkzame stoffen in het weefsel van belang te bepalen van hun effect op de site van interventie²⁰en. Aan de andere kant, heeft microdialysis een beperkte resolutie tijd (meestal meer dan 1 min te wijten aan de tijd die nodig is voor het verzamelen van monsters) in vergelijking met elektrochemische of biologische sensoren; het is een invasieve techniek waardoor weefselschade; het compromissen de neurochemical evenwicht binnen de ruimte rond het membraan als gevolg van de continue helling van de concentratie van alle oplosbare stoffen die het perfusaat samen met de analyt van belang treedt. Tot slot, de microdialysis-techniek is sterk beïnvloed door de grenzen van de analytische technieken gebruikt voor de kwantificering van stoffen in het perfusaat^9,21,22,23 . De krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) nadat de bewerking met orthophthaldialdehyde voor glutamaat en aspartaat analyse in biologische monsters is goed gevalideerde^{24,25,26 , 27} en haar uitgebreide discussie valt buiten het bereik van dit manuscript, maar de gegevens die zijn geproduceerd met behulp van deze methode zal in detail worden beschreven.

Wanneer uitgevoerd naar behoren en zonder wijziging van de samenstelling van het perfusaat, kan microdialysis bieden betrouwbare informatie over het basale niveau van de neurotransmitter release. Het grootste deel van het basale niveau is waarschijnlijk het gevolg van de zender-spill-over van de synapsen⁹. Omdat in veel gevallen de eenvoudige bemonstering van de neurotransmitter in de extra synaptic ruimte niet voldoende is om de doelstellingen van een onderzoek, kan de techniek van de microdialysis ook worden ingezet ter stimulering van neuronen of te ontnemen van belangrijke fysiologische ionen zoals K⁺ of Ca^{2 +}, te roepen of te voorkomen van het vrijkomen van de neurotransmitter.

Hoge⁺ K-stimulatie wordt het vaak gebruikt in de neurobiologie ter stimulering van de neuronale activiteit niet alleen in wakker dieren, maar ook in culturen van primaire en organotypic. De blootstelling van een gezond zenuwstelsel aan oplossingen met hoge concentraties van K⁺ (40-100 mM) roept de efflux van neurotransmitters²⁸. Dit vermogen van neuronen te bieden een extra release in reactie op de hoge K⁺ kan worden aangetast in epileptische dieren¹ en in andere neurodegeneratieve ziekten^29,30. Ook de Ca^{2 +} ontbering (verkregen door zoogdierlevercellen Ca^{2 +} gratis oplossingen) wordt gebruikt om de calcium-afhankelijke release van meeste neurotransmitters gemeten door microdialysis. Het is over het algemeen geloofd dat Ca^{2 +} afhankelijke versie van neuronale oorsprong, overwegende dat Ca^{2 +} onafhankelijke release is afkomstig uit glia, maar veel studies verhoogd controverse over de betekenis van Ca^{2 +}-gevoelige metingen van bv glutamaat of GABA⁹: dus, indien mogelijk, het is raadzaam om steun microdialysis studies met microsensor studies, omdat deze laatste hogere ruimtelijke resolutie hebben en de elektroden toestaat om dichter bij synapsen³¹.

Over microdialysis onderzoeken bij epileptische dieren is het belangrijk te benadrukken dat de gegevens die zijn verkregen van de meeste van hen afhankelijk van video of video-EEG monitoring van vangsten, dat wil zeggen, van de voorbijgaande voorkomen van tekenen en/of symptomen als gevolg van abnormale overmatig of synchrone Neuronale activiteit in de hersenen-³². Er zijn enkele specifieke kenmerken van electrographic vangsten in pilocarpine behandelde dieren die bij de voorbereiding van het experiment moeten worden onderzocht. Spontane aanvallen worden gevolgd door depressief activiteit met frequente EEG the spikes³ en optreden in clusters^33,34. Schijnvertoning bediende niet-epileptische dieren vertonen inbeslagneming-achtige activiteit³⁵ en daarom de parameters voor EEG opnames evaluatie moeten gestandaardiseerde³⁶ en, indien mogelijk, de timing van microdialysis sessies goed gedefinieerd moet worden. Ten slotte raden we na de beginselen en de methodologische standaarden voor video-EEG toezicht bij controle volwassen knaagdieren beschreven door deskundigen van de International League tegen epilepsie en American epilepsie Society in hun zeer recente verslagen^{37 ,},³⁸.

Hier beschrijven we microdialysis van glutamaat en aspartaat parallel met de lange termijn video-EEG opnamen in epileptische dieren en hun analyse in de dialysate door HPLC. Wij zullen de kritische stappen van het protocol waarmee men voor het beste resultaat zorgen moet benadrukken.