Indução de diferenciação endotelial em células progenitoras cardíacas sob condições de baixo de soro
Summary
Este protocolo descreve uma técnica de diferenciação endotelial para células progenitoras cardíacas. Centra-se sobretudo em como concentração sérica e densidade de semeadura de célula afetam o potencial de diferenciação endotelial.
Abstract
Células progenitoras cardíacas (CPCs) podem ter um potencial terapêutico para regeneração cardíaca após lesão. No coração dos mamíferos adulto, CPCs intrínsecos são extremamente escassos, mas CPCs expandidas podem ser útil para terapia celular. Um pré-requisito para a sua utilização é a sua capacidade de se diferenciar de uma forma controlada nas várias linhagens cardíacas usando protocolos definidos e eficientes. Além disso, a expansão em vitro , CPCs isolaram de pacientes ou modelos pré-clínicos doença podem oferecer ferramentas de pesquisa proveitosa para a investigação dos mecanismos da doença.
Estudos atuais usam marcadores diferentes para identificar CPCs. No entanto, nem todos eles são expressos em seres humanos, que limita o impacto translacional de alguns estudos pré-clínicos. Protocolos de diferenciação que são aplicáveis independentemente da expressão técnica e marcador de isolamento permitirá a expansão padronizada e escorva do CPCs para efeito de terapia celular. Aqui descrevemos que escorva CPCs sob uma concentração baixa de soro fetal bovino (FBS) e as condições de densidade celular baixa facilita a diferenciação endotelial dos CPCs. usando dois diferentes subpopulações de rato e rato CPCs, mostramos que a laminina é uma mais substrato adequado que fibronectina para este fim, sob o seguinte protocolo: depois para 2-3 dias em média, incluindo os suplementos que manter multipotency de cultivo e com 3,5% FBS, CPCs são semeados na laminina em < 60% confluência e cultivadas em meio livre de suplemento com baixas concentrações de FBS (0,1%) por 20-24 horas antes de diferenciação num meio de diferenciação endotelial. Porque CPCs são uma população heterogénea, concentrações séricas e tempos de incubação podem precisar ser ajustada dependendo das propriedades da respectiva subpopulação de CPC. Considerando isso, a técnica pode ser aplicada a outros tipos de CPCs também e fornece um método útil para investigar o potencial e os mecanismos de diferenciação e como eles são afetados pela doença quando usando CPCs isoladas de modelos respectivos de doença.
Introduction
Estudos recentes suportam a existência de células progenitoras cardíacas residente (CPCs) no coração dos mamíferos adultos1,2,3, e CPCs poderiam ser uma fonte útil para terapia celular após lesão cardíaca4, 5. Além disso, CPCs expandidas podem fornecer um modelo frutífero para rastreio de drogas e a investigação dos mecanismos da doença quando isoladas de pacientes com miocardiopatias raras ou de doença respectiva modelos6,7.
PCC isolado do coração adulto possuem tronco/progenitoras célula características1,2,3,8 como eles são multipotentes, clonogenic, e têm a capacidade de auto-renovação. No entanto, há muitos diferentes (sub) populações CPCs exibindo perfis de marcador de superfície diferentes, incluindo, por exemplo, c-kit, Sca-1 e outros, ou obtida por técnicas de isolamento diferentes (tabela 1). Vários protocolos de cultura e diferenciação foram estabelecidas1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Estes protocolos variam principalmente no que diz respeito a fator de crescimento e teor de soro, que são ajustadas de acordo com a finalidade do cultivo e que pode levar a diferenças nos resultados e as consequências, incluindo a eficiência de diferenciação.
Técnicas de isolamento baseados no marcador:
PCC pode ser isolados com base em um marcador de superfície específicos expressão1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Estudos anteriores sugerem que a c-kit e Sca-1 podem ser os melhores marcadores para isolar residente CPCs1,11,14,19,20. Porque nenhum desses marcadores é verdadeiramente específico para CPCs, combinações de diferentes marcadores são geralmente aplicadas. Por exemplo, Considerando que CPCs expressam baixos níveis de c-kit21, c-kit é expressa também por outros tipos de células, incluindo mastócitos22, células endoteliais23e de células tronco/progenitoras hematopoiéticas24. Um problema adicional é o fato de que nem todos os marcadores são expressos através de todas as espécies. Este é o caso da Sca-1, que se expressa no rato mas não no humano25. Portanto, usar os protocolos que são independentes dos marcadores de isolamento pode ser vantajoso, tendo em conta os ensaios clínicos e estudos usando amostras humanas.
Técnicas de isolamento de marcador independente:
Existem várias técnicas principais de isolamento do CPC, que são principalmente independentes da expressão do marcador de superfície, mas que pode ser refinado pela seleção consecutiva do específicos marcador positivo subfractions conforme necessário (Veja também a tabela 1). (1) a técnica de população (SP) lado originalmente tem sido caracterizada em uma população primitiva de células-tronco hematopoiéticas baseado na capacidade de efluxo o corante de ADN Hoechst 3334226 de ATP-binding cassette (ABC) transportadores27. Células cardíacas de SP foram isoladas por diferentes grupos e relatadas para expressar uma variedade de marcadores com algumas pequenas diferenças entre relatórios2,8,13,14. (2) células de fibroblastos de unidade formadoras de Colônia (CFU-Fs) originalmente foram definidas com base em uma célula do estroma mesenquimal (MSC)-como fenótipo. MSCs isoladas são cultivadas em pratos para induzir a formação de colônia. Tais formadoras MSC-como CFU-Fs podem ser isolado do coração adulto e são capazes de se diferenciarem em linhagens cardíaca15. (3) Cardiosphere-derivado de células (CDC) são células únicas, derivadas de aglomerados de células cultivadas a partir de biópsias do tecido ou explants28,29,30,31. Recentemente foi demonstrado que, na maior parte o CD105+/CD90–/c-kit– fração de célula exibe cardiomyogenic e potencial regenerativo32.
Aqui, usando SP-CPCs isolados de ratos, nós fornecemos um protocolo para a indução eficiente da linhagem endotelial com base em um estudo anterior em CPCs de rato e rato SP-CPCs33. O protocolo contém adaptações específicas à cultura e técnica de expansão em relação a densidade celular, o soro que integram o meio e o substrato. Isso pode ser aplicado não só ao rato SP-CPCs mas para diferentes tipos de CPCs para o propósito para induzir um interruptor de destino de uma amplificação para um CPC endotelial-cometeu, seja tendo em conta o transplante dessas células ou sua utilização para estudos mecanicistas em vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Vantagens do presente protocolo:
Este protocolo fornece uma técnica de diferenciação endotelial do CPCs. Achamos que uma concentração sérica baixa e a densidade celular baixa podem melhorar a eficiência da diferenciação endotelial, pelo qual LN provou para ser um substrato mais adequado do que FN nestas condições. Nós usamos dois tipos distintos de CPCs: rato CPCs, que foram usados em uma maneira semelhante ao linha de celular e mouse SP-CPCs, que foram isoladas e expandido. Notavelme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Vera Lorenz seu apoio útil durante as experiências e o pessoal da instalação de citometria de fluxo do departamento de Biomedicina (DBM), University e University Hospital Basel. Este trabalho foi apoiado pelo programa estadia-na pista da Universidade da Basileia (para Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster é suportado por uma concessão do Swiss National Science Foundation (número de concessão de 310030_156953).
Materials
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
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