高純度にアポトーシス小体の検出と分離

アポトーシス、プログラム細胞死のよく研究フォームは、生理的恒常性を維持し、人体¹内で潜在的有害な細胞を除去する必要があります。アポトーシスの誘導後、アポトーシス細胞 (ApoCells) は一連の形態学的変化を受けるし、ApoBDs と呼ばれる小さな膜小胞に分解できます。全体的にみて、このプロセスはアポトーシス細胞分解として知られている、形態^2,3に基づいて 3 段階に分けることができます。ステップ 1 (膜ブレブ) は、鉱物^4,5として知られている細胞の表面に風船のような構造の形成によって特徴付けられます。ステップ 2 (アポトーシス突起形成) には、apoptopodia、apoptopodia ビーズと微小管結合スパイク^6,7,8などの長い膜突起部の形成が含まれています。最後に、ステップ 3 (ApoBD 編成) にはアポトーシス突起および/または ApoBDs^6,9を生成する ApoCells の断片化が含まれています。前の調査結果は、アポトーシス細胞のクリアランスを支援し、細胞間のコミュニケーションを仲介することで ApoBDs の役割を示唆しています。たとえば、ApoBDs に、ApoCell の断片化が小さい ” 作品を一口食^2,10,11を囲むことによって簡単に削除することができますを生成可能性があります提案します。さらに、ApoBDs は、DNA、RNA および蛋白質は、細胞間コミュニケーション^12,13,14を容易にする周囲の細胞に取り引きされる可能性がありますなどの生体分子のシリーズを抱く可能性があります。これらのプロセスを調べる機能的、アポトーシス誘導および ApoBD の形成の検証 (i)、ApoBDs の分離 (ii) と (iii) ApoBD 純度の確認を含む 3 つの重要なパラメーターを確認する重要です。

以前は、アポトーシスと ApoBDs^15,16,17,18の勉強をフローサイトメトリーと電子顕微鏡を含むメソッドの数が使用されています。しかし、ApoBD の検出と定量、しばしば困難または見落とさ。例えば、最も日常的に使用される流れのフローサイトメトリーによるアポトーシス アッセイ アネキシン V を採用 (A5、外部結合タンパク質 ‘を食べる-私’ 信号ホスファチジルセリン (PtdSer)) 核酸染色 propidium ヨウ化 (PI)¹⁹。しかし、この普遍的な染色の組み合わせを使用して、解析では、のみ 3 種類のサンプルで (実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞) 細胞のサブセットがあること想定しています。さらに、cytometry 流れの試金の apoptosis のため多くの研究者によって「ゴールド スタンダード」として考慮される、しかし、以降のデータ解析はしばしば FSC/SSC^中間高イベントの選択最初のゲーティング ステップを通じて ApoBDs を除外します。したがって、A5 とする PRO 3 を使用して新規流れ cytometry 試金を最近開発した、^7、20チャンネルは別の核酸染色カスパーゼ 3/7 活性化パネキシン 1 (PANX1) によって選択的に取ることができます。カスパーゼ 3 による PANX1 活性化はアポトーシスの早い段階での PtdSer 露出を前に、ようにプロ 3 は特異的アポトーシスとネクローシス細胞を汚れ。このアプローチ戦略をゲートの小説と組み合わせてさらに、データ分析中に取得しているすべてのイベントが含まれています、6 セル/パーティクルのサブセットの識別結果としてを含む: (i) 実行可能なセル (FSC/SSC^中級/高、A5^低にプロ 3^低)、(ii) A5^–初期の ApoCells (FSC/SSC^中級/高A5^低、^中間にプロ 3)、(iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^中級/高、A5^高にプロ 3 の^中間)、(iv) 壊死細胞または後期 ApoCells (FSC/SSC^中級/高A5^高にプロ 3^高)、(v) ApoBDs (FSC/SSC^低、A5^中間に-プロ-3^低中間/)、および (vi) 破片 (FSC/SSC^低A5^低、^低にプロ 3)²⁰。我々 のアプローチでは、すべてのセル/パーティクルのサブセットと、もっと重要なは、細胞および破片²⁰からの ApoBDs の分離分析の重要性を強調しています。したがって、このアプローチは、アポトーシスおよび ApoBD の形成の誘導を同時に検証する効率的な方法を示します。

伝統的に、ApoBDs は、さまざまな細胞や密度に基づく他の細胞小胞から ApoBDs を分離できるという差動遠心分離アプローチを通じて分離されています。しかし、このようなの遠心分離法はしばしば低 ApoBD 純度、定量ステップ サンプル純度および/または細胞型特異 ApoBDs^17,21,22を分離することができないことを確認するための不足によって制限されます。そこで、最近 2 つのアプローチ、FACS に基づいた新しい差動遠心分離に基づくアプローチをアポトーシスとサンプルの純度のための²³の誘導を検証する私たち以前に確立された流れフローサイトメトリー法と結合することができますを開発しました。FACS 手法による ApoBD 分離を最大 99% 純度 ApoBDs を豊かにすることができます、さまざまな混合細胞集団、組織サンプルと体液²³から ApoBDs を分離する細胞型特異抗体と組み合わせて利用できます。さらに、我々 の改訂された差動遠心分離アプローチを示しますに ApoBDs を分離するための効率的な方法 > 90% 純度²³。

本稿で我々 はアポトーシス誘導を検証し検出し、定量化の ApoBD 形成私たちの実験の詳細について説明します。FACS ベースおよび差動遠心分離ベースのメソッドを使用して ApoBD 分離ワークフローはまた詳述し、比較しました。代表的なデータ記述の方法論では、将来の ApoBD 研究の効果的な最先端のツールをデモンストレーションします。