高纯度凋亡体的检测与分离
Summary
利用流式细胞仪或差速离心的工作流来检测、定量和分离凋亡样本中的凋亡体, 以高纯度。
Abstract
凋亡体 (ApoBDs)、微泡和外来体是胞外囊泡家族的关键成员, ApoBDs 是最大的类型之一。有人建议, ApoBDs 可以通过贩运生物分子来帮助细胞清除以及细胞间通讯。传统的 ApoBDs 识别和分离方法往往由于缺乏准确的定量和低样品纯度而受到限制。在这里, 我们描述了一个工作流, 以确认诱导的凋亡, 验证 ApoBD 的形成, 并隔离 ApoBDs 到高纯度。我们还将概述和比较荧光活化细胞分选 (ApoBDs) 和差分离心法分离的方法。此外, 使用以前建立的基于流式细胞仪的染色和分析方法, 可以确定分离 ApoBDs 的纯度。结合上述方法, THP-1 单核细胞凋亡和凋亡细胞的拆卸被诱导和验证, THP-1 单核细胞产生的 ApoBD 被隔离成纯度为97-99%。
Introduction
细胞凋亡是一种精心研究的程序性细胞死亡形式, 需要保持生理平衡, 并清除人体内潜在的有害细胞1。细胞凋亡诱导后, 凋亡细胞 (ApoCells) 可进行一系列形态学改变, 并分解成小的膜状囊泡, 称为 ApoBDs。总的来说, 这个过程被称为凋亡细胞拆卸, 可分为3个不同的步骤, 根据形态学2,3。步骤 1 (等离子膜起泡) 的特点是形成的气球状结构在细胞表面称为泡4,5。步骤 2 (凋亡突起形成) 包括长膜突起的形成, 如 apoptopodia, 串珠状 apoptopodia 和微管尖峰6,7,8。最后, 步骤 3 (ApoBD 形成) 包括凋亡突起和/或 ApoCells 的碎片生成 ApoBDs6,9。先前的研究结果表明, ApoBDs 在帮助细胞凋亡和调节细胞间沟通方面起着重要作用。例如, 建议将 ApoCell 的碎片分解为 ApoBDs 可以生成小的 “咬大小” 的碎片, 可以很容易地被周围的吞噬2,10,11。此外, ApoBDs 可能会窝藏一系列生物分子, 如 DNA、RNA 和蛋白质, 这些生物大分子可能被贩运到周围细胞, 以促进细胞通讯12、13、14。为了在功能上调查这些过程, 必须确认三关键参数, 包括 (i) 验证凋亡诱导和 ApoBD 形成, (ii) 分离 ApoBDs, (iii) 确认 ApoBD 纯度。
以前, 许多方法, 包括流式细胞术和电子显微镜已经被用来研究细胞凋亡和 ApoBDs15,16,17,18。然而, ApoBD 检测和量化往往是困难或忽视。例如, 最常规使用的流式细胞术细胞凋亡试验采用蛋白 V (A5, 一种结合外部 “吃-我” 信号磷脂 (PtdSer)) 和核酸染色碘碘化物 (PI)19的蛋白质。然而, 通过使用这种普遍的染色组合, 分析假设只有三种类型的细胞子集 (可行细胞, ApoCells 和坏死细胞) 在样本中。此外, 虽然被许多研究人员认为是 “金本位” 的细胞凋亡, 流式细胞仪检测和随后的数据分析往往排除 ApoBDs 通过一个初始浇口步骤选择 FSC/SSC中间高事件。因此, 我们最近开发了一种新的流式细胞仪检测, 使用 A5 和 TO-PRO-3, 另一个核酸染色, 可选择性地占去 caspase 3/7 激活 pannexin 1 (PANX1) 通道7,20。caspase 3 诱导的 PANX1 活化在细胞凋亡早期 PtdSer 暴露之前, TO-PRO-3 差异性染色凋亡和坏死细胞。此外, 这种方法结合我们的新的门控策略包括所有获得的事件在数据分析和结果, 六细胞/粒子子集被确定, 包括: (i) 可行的细胞 (FSC/SSC中间/高, A5低, TO-PRO-3低), (二) A5–早期 ApoCells (FSC/SSC中间/高, A5低, TO-PRO-3中间), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC中间/高, A5高, TO-PRO-3中间体), (iv) 坏死细胞或晚 ApoCells (FSC/SSC 中/高, A5高, TO-PRO-3高), (v) ApoBDs (FSC/SSC低, A5中间, TO-PRO-3低/中间体) 和 (vi) 碎片 (FSC/SSC低, A5低, TO-PRO-3低)20。我们的方法强调分析所有细胞/粒子子集的重要性, 更重要的是从细胞和碎片20分离 ApoBDs。因此, 该方法证明了一种有效的方法来验证诱导的凋亡和 ApoBD 形成同时。
传统上, ApoBDs 是通过各种不同的离心方法分离出来的, 即 ApoBDs 可以从细胞或其他基于密度的胞外囊中分离出来。然而, 这种离心方法往往受到低 ApoBD 纯度, 缺乏一个量化步骤, 以确认样品纯度, 和/或无法分离细胞类型特定的 ApoBDs17,21,22。因此, 我们最近开发了两种方法, 一种基于资产管制和一种新的差分离心方法, 可以与我们以前建立的流式细胞术方法相结合, 以验证诱导的凋亡和样品纯度23。ApoBD 隔离通过我们的基于生物传感器的方法可以丰富 ApoBDs 高达99% 纯度, 并可以结合各种细胞类型特异抗体, 以隔离 ApoBDs 从混合细胞种群, 组织样本和体液23。此外, 我们经修正的差分离心法证明了一种有效的分离 ApoBDs > 90% 纯度23的方法。
本文详细介绍了验证凋亡诱导的实验过程, 并对 ApoBD 的形成进行了检测和量化。本文还对采用基于流式和差分离心法的 ApoBD 隔离工作流进行了详细的阐述和比较。代表的数据表明, 所描述的方法为未来的 ApoBD 研究提供了一个有效的前沿工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
自二十世纪五十年代早期的描述以来, 细胞凋亡领域已取得显著进展, 成为一个突出的研究领域。尽管有广泛的兴趣和广泛的努力, 但由于缺乏适当的方法, 细胞凋亡的某些方面, 特别是 ApoBDs 的形成, 没有得到很好的研究。这些主要包括通过传统的流式细胞仪 A5/PI 分析和 ApoBD 分离的杂质同时跟踪凋亡进展和 ApoBD 形成的局限性。我们最近制定了解决这些方法缺陷的办法。
我们的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生和医学研究理事会 (GNT1125033 和 GNT1140187) 和澳大利亚研究理事会 (DP170103790) 提供给 i.k.h. P 的赠款的支持。
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
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