Caratterizzazione fisica ad alta risoluzione di nanoparticelle metalliche singole
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare cluster di ossigeno metallico discreti, poliossimetalati (POM), al limite di singole molecole utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Il metodo fornisce un approccio complementare agli strumenti chimici analitici tradizionali utilizzati nello studio di queste molecole.
Abstract
Le singole molecole possono essere rilevate e caratterizzate misurando il grado con cui riducono la corrente ionica che scorre attraverso un singolo poro su scala nanometrica. Il segnale è caratteristico delle proprietà fisico della molecola e delle sue interazioni con il poro. Dimostriamo che i nanopori formati dalla proteina batterica exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (ZHL) sono in grado di rilevare i poliossimiti (POM, ammassi di ossigeno anionico), al limite della singola molecola. Inoltre, più prodotti di degradazione di 12-foshotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in soluzione sono misurati simultaneamente. La sensibilità a singola molecola del metodo nanoporo consente di caratterizzare i POM a concentrazioni significativamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica potrebbe servire come nuovo strumento per i chimici per studiare le proprietà molecolari dei poliossimetalati o di altri cluster metallici, per comprendere meglio i processi sintetici POM e possibilmente migliorare la loro resa. Ipoteticamente, la posizione di un dato atomo, o la rotazione di un frammento nella molecola, e lo stato di ossidazione del metallo potrebbero essere studiati con questo metodo. Inoltre, questa nuova tecnica ha il vantaggio di consentire il monitoraggio in tempo reale delle molecole in soluzione.
Introduction
Il rilevamento di analiti biomolecolari a livello di singola molecola può essere eseguito utilizzando nanopori e misurando modulazioni di corrente ionica. Tipicamente, i nanopori sono divisi in due categorie in base alla loro fabbricazione: biologica (auto-assemblata da proteine o origami di DNA)1,2,3o stato solido (adesempio, prodotto con strumenti di elaborazione dei semiconduttori)4,5. Mentre i nanopori allo stato solido sono stati suggeriti come potenzialmente più robusti fisicamente e possono essere utilizzati in un’ampia gamma di condizioni di soluzione, i nanopori proteici finora offrono una maggiore sensibilità, maggiore resistenza all’incrostazione, una maggiore larghezza di banda, una migliore chimica selettività e un maggiore rapporto segnale/rumore.
Una varietà di canali ionici proteici, come quello formato da Staphylococcus aureus –emolysina ( , può essere utilizzato per rilevaresingolemolecole, compresi gli ioni (ad es. e RNA)6,7,8, DNA danneggiato9, polipeptidi10, proteine (piegate e spiegate)11, polimeri (glicole di polietilene e altri)12,13 , 14, nanoparticelle d’oro15,16,17,18,19e altre molecole sintetiche20.
Recentemente abbiamo dimostrato che il nanoporo di HL può anche facilmente rilevare e caratterizzare ammassi metallici, poliossimetalati (POM), a livello di singola molecola. I POM sono cluster di ossigeno metallici su scala nanometrica discreti che sono stati scoperti nel 182621, e da allora, molti altri tipi sono stati sintetizzati. Le diverse dimensioni, strutture e composizioni elementali di poliossimetalati che sono ora disponibili hanno portato a una vasta gamma di proprietà e applicazioni tra cui chimica22,23, catalisi24, scienza dei materiali25 ,26, e ricerca biomedica27,28,29.
La sintesi POM è un processo di auto-assemblaggio tipicamente eseguito in acqua mescolando le quantità stoichiometricamente richieste di sali metallici monomerici. Una volta formati, i POM mostrano una grande diversità di dimensioni e forme. Ad esempio, la struttura in polianione di Keggin, XM12O40q- è composta da un eteroatoma (X) circondato da quattro ossigeno per formare un tetraedro (q è la carica). L’eteroatomo si trova in posizione centrale all’interno di una gabbia formata da 12 ottaedriMO MO6 unità (dove M – metalli di transizione nel loro stato di alta ossidazione), che sono collegati tra loro da atomi di ossigeno condivisi vicini. Mentre la struttura dei tungsteno poliossimetalati è stabile in condizioni acide, gli ioni idrossidi portano alla scissione idrolitica dei legami metallo-ossigeno (M-O)30. Questo complesso processo comporta la perdita di una o più sottounità ottahedrali MO6, che porta alla formazione di specie monovacanti e trivacanti e alla fine alla completa decomposizione dei POM. La nostra discussione qui sarà limitata ai prodotti di decomposizione parziale dell’acido 12-foshotungstic a pH 5.5 e 7.5.
L’obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare cluster di ossigeno metallico discreti al limite di singola molecola utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Questo metodo consente il rilevamento di cluster metallici nella soluzione. Più specie in soluzione possono essere discriminate con maggiore sensibilità rispetto ai metodi analitici convenzionali33. Con esso, sottili differenze nella struttura POM possono essere chiarite, e a concentrazioni nettamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia NMR. È importante sottolineare che questo approccio consente anche la discriminazione delle forme isomeriche di Na8HPW9O341.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa della loro carica anionica, i POM probabilmente si associano alle contro-zioni organiche attraverso interazioni elettrostatiche. Pertanto, è importante identificare le condizioni di soluzione appropriate e gli ambienti elettrolitici corretti (in particolare le cazioni nella soluzione) per evitare la formazione complessa con i POM. Particolare attenzione è necessaria nella scelta del buffer. Ad esempio, la velocità di acquisizione dei POM con soluzioni tris(idrossimetile) aminomethane e citrico-buffered è sign…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il sostegno finanziario dell’Organizzazione europea di biologia molecolare per una borsa di studio post-dottorato (a J.E.) e una sovvenzione del NIH NHGRI (a J.J.K.). Apprezziamo l’aiuto dei professori Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Columbia University) per aver fornito eptameric SRl, e per aver ispirato le discussioni con il professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
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