Fysische karakterisering van enkele metallische nanodeeltjes in hoge resolutie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van discrete metalen zuurstof clusters, polyoxometalates (POMs), bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. De methode biedt een complementaire benadering van traditionele analytische chemie instrumenten die worden gebruikt in de studie van deze moleculen.
Abstract
Individuele moleculen kunnen worden gedetecteerd en gekarakteriseerd door het meten van de mate waarin ze de Ionische stroom die door een enkele nanometer-schaal porie stroomt, verminderen. Het signaal is kenmerkend voor de fysisch-chemische eigenschappen van het molecuul en de interacties met de porie. We tonen aan dat de nanopore gevormd door de bacteriële proteïne exotoxin Staphylococcus aureus alpha gemolizinami (αhl) kan detecteren polyoxometalates (POMs, anionische metaal zuurstof clusters), bij de enkelvoudige molecuul limiet. Bovendien worden meerdere afbraakproducten van 12-foshotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in oplossing gelijktijdig gemeten. De gevoeligheid van één molecuul van de nanometer-methode maakt het mogelijk dat POMs wordt gekenmerkt bij significant lagere concentraties dan nodig is voor nucleaire magnetische resonantie (NMR)-spectroscopie. Deze techniek kan dienen als een nieuw hulpmiddel voor chemici om de moleculaire eigenschappen van polyoxometalaten of andere metallische clusters te bestuderen, om POM synthetische processen beter te begrijpen en hun opbrengst mogelijk te verbeteren. Hypothetisch gezien kon de locatie van een bepaald atoom, of de rotatie van een fragment in het molecuul, en de metaal oxidatietoestand met deze methode worden onderzocht. Daarnaast heeft deze nieuwe techniek het voordeel dat het real-time monitoren van moleculen in oplossing mogelijk is.
Introduction
Het opsporen van biomoleculaire analyten op het enkelvoudige molecuul niveau kan worden uitgevoerd door het gebruik van nanodeeltjes en het meten van ionogene stroom modulaties. Meestal zijn nanodeeltjes onderverdeeld in twee categorieën op basis van hun fabricage: biologisch (zelf samengesteld uit eiwitten of DNA-origami)1,2,3of Solid-State (bijv.vervaardigd met Semiconductor processing tools)4,5. Terwijl Solid-State nanopores werden gesuggereerd als potentieel meer fysiek robuust en kunnen worden gebruikt over een breed scala aan oplossings omstandigheden, eiwit nanodeeltjes tot nu toe bieden meer gevoeligheid, meer weerstand tegen vervuiling, grotere bandbreedte, betere chemische selectiviteit en een grotere signaal-ruis verhouding.
Een verscheidenheid aan eiwitionen kanalen, zoals die gevormd door Staphylococcus aureus α-hemolysine (αhl), kan worden gebruikt voor het opsporen van enkelvoudige moleculen, waaronder ionen (bijv.H+ en D+)2,3, polynucleotiden (DNA en RNA)6,7,8, beschadigd DNA9, polypeptiden10, eiwitten (gevouwen en uitgeklapt)11, polymeren (polyethyleenglycol en andere)12,13 , 14, goud nanodeeltjes15,16,17,18,19, en andere synthetische moleculen20.
We hebben onlangs aangetoond dat de αHL-nanometer ook metalen clusters, polyoxometalaten (POMs), op het niveau van één molecuul gemakkelijk kan detecteren en karakteriseren. POMs zijn discrete nanoschaal anionische metalen zuurstof clusters die werden ontdekt in 182621, en sindsdien zijn veel meer soorten gesynthetiseerd. De verschillende maten, structuren en elementaire composities van polyoxometalates die nu beschikbaar zijn, leidden tot een breed scala aan eigenschappen en toepassingen, waaronder chemie22,23, katalyse24, material Science25 ,26, en biomedisch onderzoek27,28,29.
POM synthese is een zelf assemblageproces dat gewoonlijk in water wordt uitgevoerd door de stoichiometrisch vereiste hoeveelheden monomere metaalzouten te mengen. Eenmaal gevormd, POMs vertonen een grote diversiteit van maten en vormen. Bijvoorbeeld, de keggin polyanion structuur, XM12O40q- is samengesteld uit een bevat (X) omgeven door vier oxygenen om een tetraëder te vormen (q is de lading). Het bevat is centraal gelegen in een kooi gevormd door 12 octaëdrisch mo6 eenheden (waar M = overgangsmetalen in hun hoge oxidatietoestand), die met elkaar verbonden zijn door naburige gedeelde zuurstofatomen. Hoewel de structuur van Tungsten polyoxometalates stabiel is in zure omstandigheden, leiden hydroxyionen tot het Hydrolytische decolleté van metaal-zuurstof (M-O)-bindingen30. Dit complexe proces resulteert in het verlies van een of meer MO6 Octahedrale subeenheden, wat leidt tot de vorming van monovacant en vrijgekomen soorten en uiteindelijk tot de volledige ontleding van de POMs. Onze bespreking hier zal beperkt zijn tot de partiële ontledingsproducten van 12-fosfolienzuur bij pH 5,5 en 7,5.
Het doel van dit protocol is het detecteren van discrete metaal zuurstof clusters bij de enkelvoudige molecuul limiet met behulp van een biologisch nano-gebaseerd elektronisch platform. Deze methode maakt de detectie van metaal clusters in oplossing mogelijk. Meerdere soorten in oplossing kunnen worden gediscrimineerd met een grotere gevoeligheid dan conventionele analytische methoden33. Met het, subtiele verschillen in POM structuur kan worden opgehelderd, en in concentraties duidelijk lager dan die nodig zijn voor NMR-spectroscopie. Belangrijk, deze aanpak maakt zelfs de discriminatie van isomere vormen van na8HPW9O341.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door hun anionische lading associëren POMs waarschijnlijk met organische contra kationen door elektrostatische interacties. Daarom is het belangrijk om te bepalen van de juiste oplossing voorwaarden en de juiste elektrolyt omgevingen (met name kationen in oplossing) om te voorkomen dat complexe vorming met POMs. Bijzondere aandacht is vereist in de keuze van de buffer. Bijvoorbeeld, de opnamesnelheid van POMs met tris (hydroxymethyl) aminomethaan en citroenzuur-gebufferde oplossingen is significant lager dan die in fosf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar voor de financiële steun van de Europese organisatie voor moleculaire biologie voor een postdoctoraal Genootschap (aan j) en een subsidie van het NIH NHGRI (naar J.J.K.). We waarderen de hulp van professoren Jingyue Ju en Sergey Kalachikov (Columbia University) voor het verstrekken van heptameric αHL, en voor inspirerende discussies met professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).
Materials
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. . Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer’s disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. . Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
