烟草 Benthamiana叶在制备鳞片上的瞬态表达

注:在遵循本协议之前, 熟悉所有使用过的物质的安全数据, 并采取适当的安全防范措施。这些措施包括但不限于: 在真空下使用玻璃时佩戴安全眼镜, 以及在通风柜中处理干硅胶。还必须对有关使用转基因材料的地方立法进行检查和观察, 包括遵循适当的遏制程序。 1. 生成一株用于浸润的农杆菌菌株 注:我们在此提供了一个简化的描述, 用于生成合适的. 这些步骤的进一步细节由塞恩斯等人描述。8。 通过 PCR 或合成感兴趣基因的蛋白质编码区, 由 5 ‘ 和 3 ‘ attB 序列, 适合于特定于站点的重组克隆协议18,19, 用于生成条目克隆。 使用前底漆: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, 反向底漆: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN… = 序列特定序列)。 使用 (代表性) PCR 条件: 反应混合物 (25 µL, 总计), 缓冲器 (5x, 5 µL, 见材料表), dNTPs (10 毫米, 0.5 µL), 正向底漆 (10 µM, 1.25 µL), 反向底漆 (10 µM, 1.25 µL), 模板 DNA (可变浓度, 50-250 ng, 0.5 µL), DNA 聚合酶 (2000 U/毫升, 0.25 µL, 见材料表), 无核酸酶水 (到25µL)。运行 thermocycler 如下: 初始变性 (98 °c, 三十年代);开始周期 (98 °c, 三十年代; 45-72 °c, 二十年代; 72 °c, 三十年代/kb) 结束周期;35个周期;最后延伸 (72 °c, 10 分钟)。 遵循标准的站点特定的重组克隆协议18,19 , 使用任何非卡那霉素的入口向量生成一个条目克隆 (我们使用的 pDONR207 是商业上可用的)。注:在使用生成 pEAQ DEST1 表达式构造之前, 应通过排序确认条目克隆的完整性.pEAQ-DEST1是可利用的要求从 Lomonossoff 实验室在约翰 Innes 中心在英国诺里奇。 将 pEAQ DEST1 矢量与步骤1.1.3 中生成的表达式克隆隔离, 并在步骤1.3 中使用之前存储在-20 摄氏度。注:任何商业上可用的方便自旋柱基质粒纯化试剂盒的设计, 从克隆菌株的大肠杆菌是合适的。按照所选质粒纯化试剂盒的具体说明 (见材料表)。 为转换准备化学上合格的农杆菌。 接种选择性磅 (Luria-Bertani 培养基:10 克/升 bacto-胰蛋白胨, 10 克/升氯化钠, 5 克/升酵母萃取物, 琼脂10克/升 pH 值 7.0) 琼脂板 (50 微克/毫升利福平, 100 微克/毫升链霉素), 通过裸奔a. 农杆菌LBA4404 从甘油的股票文化。一夜之间孵化在28°c 在一个常设孵化器。 接种50毫升选择性液体 LB 介质 (50 微克/毫升利福平, 100 微克/毫升链霉素), 并从步骤1.2.1 的 LBA4404 细胞的样本.孵化过夜在28°c 在一个震动孵化器在200转每分钟。 冷却的文化从步骤1.2.2 冰10分钟, 然后颗粒的A. 农杆菌细胞离心在4°c 和 4500 x g 5 分钟 (丢弃上清)。 并用重悬 1.2.3 1 毫升的冰冷20毫米水 CaCl2溶液中的颗粒, 并从步骤1.2.3 重复离心步骤 (丢弃上清)。 并用重悬从步骤1.2.4 在1毫升冰冷20毫米水 CaCl2溶液中的颗粒, 整除导致悬浮在50µL 批次。闪光冻结的整除数在液体 N2和存储在-80 摄氏度之前使用。 用步骤1.2 中生成的隔离 pEAQ-HT-DEST1 向量转换准备好的 LBA4404 . 解冻50µL 的A.在冰上步骤1.2 产生的农杆菌悬浮, 并孵育 100 \ u2012 200 ng 的孤立的 pEAQ-HT-DEST1 向量, 生成的步骤 1.1, 在0°c 5 分钟。 冷休克的孵化悬浮从步骤1.3.1 在液体 N2三十年代, 然后允许温暖的室温。 添加 200 ul 的 soc 介质 (soc:20 克/升 bacto-胰蛋白胨, 5 克/升酵母提取物, 0.58 克/升氯化钠, 0.19 克/升氯化钾, 2.03 克/升氯化镁2, 2.46 克/升硫酸镁7水合物, 3.6 克/升葡萄糖) 到冷休克悬浮从步1.3.2 和孵化为4小时在28°C 在摇晃的孵化器在200转每分钟。 接种一个选择性 LB 琼脂板 (50 微克/毫升利福平, 50 微克/毫升卡那霉素, 100 微克/毫升链霉素) 与 SOC 文化从步骤1.3.3。彻底传播, 并孵化3天在28°c 在一个常设孵化器。 接种5毫升选择性 LB 培养基 (50 微克/毫升利福平, 50 微克/毫升卡那霉素, 100 微克/毫升链霉素) 与一个单一的殖民地从步骤1.3.4。孵化过夜在28°c 在一个震动孵化器在200转每分钟。 添加 200 ul 的甘油到1毫升的液体养殖从步骤 1.3.5, 彻底混合, 并存储在-80 摄氏度。注:这种文化可以恢复到未来的实验通过裸奔到 LB 琼脂板与适当的抗生素 (如下所述)。 2. 准备渗透悬浮液 在步骤1中产生的甘油种群培养基中接种一株选择性的 LB 琼脂板, 其条纹为所需的.一夜之间孵化在28°c 在一个常设孵化器。注:在 pEAQ-HT-DEST1 向量内携带tHMGR的应变也可能包括在内。 单独接种50毫升选择性 LB 培养基, 每个 a 的样本. 在步骤2.1 中生长的农杆菌菌株, 并在28摄氏度在一个摇晃的孵化器中以200转每晚孵化。 从步骤2.1.1 到1000毫升的选择性 LB 培养基 (利福平50微克/毫升, 卡那霉素, 50 微克/毫升链霉素/毫升), 并在100摄氏度的一夜之间, 在一个摇晃的孵化器中单独转移50毫升的培养基 28 rpm。 通过离心 (4000 x g), 从步骤2.1.2 中产生的液体培养物中分离出 A. 单独并用重悬从步骤2.1.3 在50毫升新制备的 mma 缓冲器 (mma 缓冲器:10 毫米 2-(n-吗啉代)-ethanesulphonic 酸, pH 5.6 (KOH), 10 毫米氯化镁2, 150 微米 3 ‘ 5 ‘-藜 4 ‘-苯乙酮) 和在室温下孵化黑暗的1小时。 将每个a的适当体积组合在一起 (在步骤2.1.4 中生成), 以在10升总最终体积内为每种应变产生至少0.2 的最终 OD600 。 将附加的 MMA 缓冲器添加到步骤2.1.5 中生成的复合悬浮液中, 最终体积为1升 (在步骤3中立即使用)。注:在渗透过程中, 为保持液位, 最好准备另外2升的渗悬浮液。 准备1升10x 的强力 MMA 缓冲器。 3. 进行真空渗透 注:请参见图 2 , 说明真空渗透装置的结构。使用5周大的benthamiana植物在 9 cm x 9 cm 罐为操作步骤。幼苗应播种在 F1 堆肥 (例如从犁庭扫穴) 和种植2周前被转移到单独的盆含有 F2 堆肥。植物应该生长在25摄氏度的温室中, 每天有16小时的光照 (必要时使用辅助照明), 每天浇水, 最大密度为100株/米2。 将步骤2中生成的1升渗透悬浮液和1升的10x 强力 MMA 缓冲液转移到渗透浴中, 再加8升水。 删除定制的植物持有人的可拆卸的翼, 插入4棵植物 (5 星期老植物看见前面笔记), 并且重新连接翼。将保持架和放置在渗透浴的顶部, 以便将叶子浸入渗透悬浮液中。注:确保悬浮液位达到厂架顶面。如果需要, 增加额外的渗透悬浮液的水平。 将浸入式浴缸与浸没的植物转移到入渗室并关上门。确保吸收上的进气阀门关闭。打开真空泵, 将内联阀打开到真空储罐中, 然后将真空进气阀放进入渗室。 一旦渗透腔内的压力降低了880毫巴, 关闭真空进气阀, 打开进气阀门。一旦渗透室回到大气压, 打开门, 并删除渗透浴。 提高植物的持有者, 直到植物不再淹没在渗透悬浮, 然后轻轻摇动持有者允许过剩的悬浮跑掉的叶子回到渗透浴。 将持票人返回直立位置, 取下可拆卸的机翼, 取出植株。 重复步骤3.1.1 到 3.1.5, 直到所需的植物数量被渗透。 蒸压釜使用前的渗透悬浮处理。 在随后的实验中再利用之前, 先用高压釜进行渗透浴。 用70% 乙醇清洗并在随后的实验中再利用前离开空气干燥, 对渗透室内部进行消毒。 4. 种植渗透植物 在温室中, 以100株/米2的最大密度从步骤3排列渗透植物。 生长5天在25摄氏度和16小时每天的光 (使用补充照明时, 需要), 和水每天。 5. 收获被渗透的叶子 经过5天的成长, 收获了树叶。 蒸压釜废料厂的物料、花盆和土壤处置前。 6. 干燥收获的叶子 注:下面描述的确切的冻干过程取决于可用的冻干装置的性质。 Lyophilize 收获的叶子, 直到干燥。 将收获的叶子放在2毫米厚的聚丙烯袋中。将收获的叶子冷冻在-80 摄氏度冷藏库中, 保存30分钟。 用别针在袋子上打上许多小孔。把袋装的冷冻树叶放在冻干机中央的房间里。确保所有的烧瓶附件水龙头都关闭, 然后打开冻干机。确保冷凝器达到至少-50 摄氏度, 压力降低到至少0.15 毫巴, 然后一夜之间离开。 关闭冻干机和排气真空通过打开一个烧瓶附件水龙头。从中央腔中取出干燥的叶子, 然后进行步骤7。 7. 加压溶剂萃取 注:程序步骤是指使用商业上可用的 PSE 仪器 (见材料表)。有关操作的详细信息, 请参阅制造商的文献。该仪器并行进行4提取。 通过一种方便的方法将干燥的叶子研磨成一粒粉末 (例如,对于多数三萜类化合物, 使用家用食品处理器, 或者在包内手动粉碎叶子)。注:通常不需要用杵和砂浆在液氮下研磨。 将叶粉与石英砂 (0.3 \ u2012 0.9 毫米, 20% 按体积) 混合在适当的容器内;这起到了分散剂的作用, 提高了萃取过程的效率。 准备4个提取细胞 (120 毫升) 填充。为此, 反转萃取单元并插入玻璃纤维过滤器, 接着是金属熔块和保温插头。将萃取单元返回到直立位置, 并添加1厘米深的石英砂层 (0.3 \ u2012 0.9 毫米)。 填充抽取单元格。 用在步骤7.1 中生成的准备好的叶粉填充萃取单元, 直至填充线。如果需要, 在这个过程中轻轻地压缩粉末, 以便在每个萃取单元中增加更多的量。 添加一小层石英砂 (0.3 \ u2012 0.9 毫米) 到包装粉顶部, 并插入顶部纤维素过滤器。 将填充的提取单元插入 PSE 仪器并运行所需的方法。使用下列设置和材料;溶剂: 100% 乙酸乙酯;温度: 100 °c, 压力: 130 巴。运行3循环如下: 周期 1: 0 分钟保持时间, 周期2和 3: 5 分钟保持时间, 结束与2分钟溶剂冲洗, 和12分钟氮气冲洗。注:最好先对小尺度下的萃取方法进行优化。然而, 下面的方法通常是足够的氧化三萜苷元。每个萃取单元的白酒可以通过指定废物线作为提取目标, 而不是标准的单独的收集线, 结合在同一外部收集容器中。注意所用溶剂的用量取决于萃取单元的包装和设定的温度和压力。上述方法通常产生约800毫升提取液4平行萃取。 重复步骤7.2 至 7.3.3, 直到所有的叶粉被处理。 将组合萃取液浓缩成干燥, 通过真空旋转蒸发。检查预期产量 (即深绿色泥浆)。注:具体的程序可能会因设置可用的旋转蒸发器而有所不同。在执行旋转蒸发时, 应始终佩戴眼部防护, 并在真空条件下检查玻璃器皿是否损坏。 打开冷水机回收器, 并允许热传导液冷却到至少5摄氏度。打开水浴, 将温度设置为35摄氏度。 将萃取液转移到蒸发瓶中 (不要填满瓶中一半以上的体积)。如果总容积超过这一量, 将酒的批次 (在同一瓶中) 集中。将填充的蒸发烧瓶连接到旋转蒸发器的蒸气管 (用关节夹固定)。 调整烧瓶的升降位置和角度, 以近似45°角将蒸发瓶的底部第三个浸入水浴中。开始的瓶子旋转的速度, 开始蔓延的萃取液的瓶子的墙壁。 确保排气水龙头关闭, 并开始减少压力 (使用真空泵的控制器), 直到在冷凝器和接收器之间观察到适度的滴水。注:不要让萃取液开始沸腾。如果发生这种情况, 减少真空的强度, 使蒸馏得到控制。 监测和调整真空强度和旋转速度的适当, 直到所有的溶剂被蒸发。 8. 碱性离子交换树脂去除叶绿素的方法 注:以下步骤中引用的数量假定为 100 \ u2012 150 工厂的原始工作规模。步骤8不适用于含有羧酸基团的产品, 或在诸如酯类等基本条件下水解的功能基团。 溶解在步骤7中生成的少量乙醇的粗萃取物。 添加50毫升的碱性离子交换树脂珠 (见材料表), 以输出的步骤 7.1.1, 并在室温下摇动30分钟。注:不要用震动来代替搅拌装置的使用。磁性或机械的头顶搅动会损害树脂珠子的完整性。适当的搅拌也可以方便地实现通过缓慢旋转的反应瓶在旋转蒸发器与真空设置在大气压或断开。 每30分钟添加50毫升碱性离子交换树脂珠, 直到反应完成;碱性离子交换树脂珠的颜色会从粉红色变为绿色, 而液相则会由绿色变为橙色, 或视比例而变暗褐色。 如果有疑问, 反应已经完成, 样品0.5 毫升的液体。通过硅藻土的一小柱过滤样品, 观察滤液的颜色;反应通常在1.5 小时之内完成。 用硅藻土的短柱过滤反应混合物。 通过真空过滤, 或通过用手波纹管的玻璃闪光色谱柱施加压力来执行此操作。如果过滤速度减慢, 用搅拌棒扰乱硅藻土垫的顶部。收集滤液。 用乙醇冲洗所收集的树脂珠子, 后跟1:1 乙醇: 己烷, 最终己烷。使用足够的冲洗量并用重悬在硅藻土柱顶部的珠子。 将滤液与步骤8.4 相结合, 从步骤8.5 中冲洗出来, 在真空下将其浓缩成干燥。 9. 初始粗分馏 注:以下方法通常适用于典型氧化三萜苷元, 并采用自动闪光层析仪。有关操作的详细信息, 请参阅制造商的文献。 将步骤8中生成的粗产品吸附到闪光级硅胶 (孔径:60 Å, 粒度:35 \ u2012 75 微米), 用于通过干荷载方法应用于闪光色谱盒。 将步骤8中生成的原油分解成最小体积的适当有机溶剂。确保完全溶解。注:二氯甲烷与少量甲醇的加法通常是适当的溶剂选择。 拧开100克预先填入闪光色谱盒的顶部 (见材料表), 取出插入物以显示干装头空间。使用头部空间来测量合适的硅凝胶体积以进行干荷载。 将所测的硅胶的测量量转移到原油的溶液中, 然后在真空下通过旋转蒸发去除溶剂。注: 硅胶应返回自由流动的粉末。在蒸发过程结束时, 可能需要温和的刮擦, 从蒸发瓶的侧面释放硅胶。 平衡100克闪光色谱盒在100毫升/分钟, 至少5列体积100% 己烷, 但理想的是, 直到墨盒的内容完全和均匀润湿。 将步进9.1.3 中产生的制备的干加载二氧化硅凝胶转移到平衡100克闪光色谱盒的干装头空间, 通过浇注。悬浮在己烷和宽嘴吸管可以用来帮助转移任何剩余的干加载硅胶。 用100% 己烷将所转移的干装硅胶床湿润, 从干荷载顶空中除去空气。 运行以下色谱法: 溶剂 [A]: 己烷, 溶剂 [B]: 醋酸乙酯, 流速: 100 毫升/分, 梯度: 0% [b] 到 100% [b] 3000 毫升, 收集: 收集全部, 分数大小: 250 毫升。 用薄层色谱法 (TLC)8或气相色谱-质谱法 (gc-ms)8对馏分进行了分析, 并通过真空下的旋转蒸发, 将含有感兴趣化合物的分数进行干燥。 进行下游精细净化, 直到达到理想的纯度水平。注:下游精细提纯完全是复合型的, 不可能提供标准化的步骤 (参见讨论部分)。