Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta
Summary
Este protocolo descreve uma metodologia eficiente para a extração e quantificação de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. e um processo experimental para avaliar a atividade enzimática da cafeína sintase com o nível de expressão de o gene que codifica esta enzima.
Abstract
(1,3,7-trimethylxanthine) a cafeína é um alcaloide de Purina, presente em bebidas populares como café e chá. Este metabolito secundário é considerado como uma defesa química, porque tem atividade antimicrobiana e é considerado um inseticida natural. Cafeína também pode produzir efeitos alelopático negativos que impedem o crescimento das plantas circunvizinhas. Além disso, as pessoas ao redor do mundo consomem cafeína para seus efeitos analgésicos e estimulante. Devido ao interesse nas aplicações tecnológicas da cafeína, pesquisa sobre o caminho biossintético deste composto tem crescido. Estes estudos centraram-se principalmente na compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares que regulam a biossíntese de cafeína. Cultura de tecidos in vitro tornou-se um sistema útil para estudar este caminho biossintético. Este artigo irá descrever um protocolo passo a passo para a quantificação de cafeína e para medir os níveis de transcrição do gene (CCS1) codificação cafeína sintase (CS) em suspensões celulares de c. arabica L., bem como a sua actividade.
Introduction
A cafeína é um metabólito secundário que é biossintetizados por plantas do gênero Coffea1. Este alcaloide pertence à família de methylxanthine e é considerado como uma defesa da planta química, porque ele pode agir contra os efeitos nocivos de patógenos e herbívoros de2,3. Além disso, este metabólito é responsável para as propriedades estimulantes da bebida café, que é comumente consumida em todo o mundo4,5. Devido a suas propriedades, diversos grupos de pesquisa estão interessados em estudar o caminho biossintético e catabolismo de cafeína6,7. Atualmente, a planta em vitro culturas de célula/tecido servem como uma alternativa para avaliar acúmulo de cafeína sob várias estratégias bióticos e abióticos8,9.
Biossíntese de cafeína envolve a liberação hidrolítica de 7-methylxanthine do correspondente nucleosídeo ribose seguido por ordenada de N-methylations nas posições 3 e 1. Um específico S– adenosilmetionina (SAM)-N-metiltransferase dependente (NMT) catalisa a metilação na posição 7, Considerando que a teobromina sintase (TS) e CS estão envolvidos na 3 – e 1-methylations, respectivamente, produzindo teobromina e cafeína. O estudo dos genes que codificam NMTs distintas permitiu compreender o mecanismo que regula a produção de cafeína10,11. CS, que tem N –metiltransferase atividade, catalisa as duas últimas etapas da via biossintética de cafeína11. Em mudas de árvores de café, ficou demonstrado que a radiação luminosa pode aumentar atividade CS, o que resulta em um aumento na biossíntese de cafeína. Recentemente, nós mostramos que a manutenção das suspensões celulares de c. arabica L. sob irradiação de luz é a condição ideal para avaliar os efeitos que produzem fatores de estresse abiótico que impactam o caminho biossintético de cafeína8. As informações obtidas nesses estudos podem ter aplicações em biologia de sistemas e engenharia metabólica para maximizar o estudo da via biossintética de cafeína em tais sistemas em vitro .
Dadas as vantagens de se obter um modelo adequado para o estudo da biossíntese de cafeína, nós aperfeiçoamos as condições de extração de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. Também foi possível desenvolver um protocolo útil para estudar a atividade enzimática, bem como os passos metodológicos para avaliação do nível de transcritos do gene de Coffea cafeína sintase 1 (CCS1) codificação desta enzima. Neste documento, nós relatamos um protocolo para extrair e quantificar a cafeína em suspensões celulares de c. arabica por cromatografia em camada delgada e densitometria (TLC-densitometria).
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos aqui as condições ideais para avaliar a conteúdo de cafeína, os níveis de atividade e transcrição de CS em um em vitro planta cultura de tecidos, tais como suspensões celulares de c. arabica. Relatórios anteriores confirmaram que mantém as células sob irradiação de luz e na presença de teobromina em meio de cultura são parâmetros adequados para aumentar o nível de cafeína, tornando possível a avaliação dos métodos de separação de cafeína usando a cromatografia líqu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho do nosso laboratório foi financiado por uma concessão do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) para SMTHS. Esta pesquisa também foi apoiada por uma bolsa de estudos concedida a RJPK (n. º 37938) pelo CONACyT e o Sistema Nacional de Investigadores (4422). Os autores graças a CIATEJ para a utilização das suas instalações durante a escrita deste manuscrito. Agradecimentos especiais são estendidos ao Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas as recomendações na seção de biologia molecular e Valentín Rodríguez de Mendoza, IFC, UNAM para as instalações durante as filmagens deste artigo.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
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