Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen
Summary
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de extractie en kwantificering van cafeïne in cel suspensies van C. arabica L. en een experimentele proces voor de evaluatie van de enzymatische activiteit van cafeïne synthase met het niveau van de expressie van het gen dat dit enzym codeert.
Abstract
Cafeïne (1,3,7-trimethylxanthine) is een purine alkaloïde in populaire dranken zoals koffie en thee aanwezig. Deze secundaire metaboliet wordt beschouwd als een chemische verdediging, omdat het heeft antibacteriële activiteit en wordt beschouwd als een natuurlijke insecticide. Cafeïne kan ook negatieve allelopatische effecten die voorkomen de groei van de omringende planten dat produceren. Bovendien, verbruiken mensen over de hele wereld cafeïne voor de pijnstillende en stimulerend gevolgen. Als gevolg van de interesse in de technologische toepassingen van cafeïne, onderzoek naar de biosynthetic traject van dit samengestelde gegroeid. Deze studies zijn primair gericht op het begrijpen van de biochemische en moleculaire mechanismen die de biosynthese van cafeïne regelen. In vitro weefselkweek is uitgegroeid tot een nuttig systeem voor de studie van dit biosynthetic traject. Dit artikel beschrijft een stapsgewijze protocol voor de kwantificering van cafeïne en voor het meten van de niveaus van de transcriptie van het gen (CCS1) codering cafeïne synthase (CS) in cel suspensies van C. arabica L., alsmede haar activiteit.
Introduction
Cafeïne is een secundaire metaboliet thats levende door planten van het geslacht Coffea1. Dit alkaloïde behoort tot de familie van de methylxanthine en wordt beschouwd als een chemische fabriek verdediging, omdat het tegen de negatieve effecten van ziekteverwekkers en planteneters2,3 optreden kan. Deze metaboliet is daarnaast verantwoordelijk voor de stimulerende eigenschappen van de koffie drinken, die vaak verbruikt wereldwijd4,5. Als gevolg van zijn eigenschappen, zijn verschillende onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het bestuderen van de biosynthetic traject en het katabolisme van cafeïne6,7. Momenteel, dienen plant in vitro cel/weefselcultures als alternatief voor de evaluatie van cafeïne accumulatie onder verschillende biotische en abiotische strategieën8,9.
Cafeïne biosynthese impliceert de Hydrolytische release van 7-methylxanthine van de overeenkomstige ribose nucleoside gevolgd door bestelde N-methyleringen op positie 3 en 1. Een specifieke S– adenosyl methionine (SAM)-afhankelijke N-methyltransferase (NMT) katalyseert de Methyleren aan positie 7, overwegende dat theobromine synthase (TS) en CS zijn betrokken in de 3 – en 1-methyleringen, respectievelijk produceren theobromine en cafeïne. De studie van genen coderend voor verschillende meetposten heeft toegestaan het mechanisme dat cafeïne productie10,11 regeltte begrijpen. CS, heeft N –methyltransferase activiteit, katalyseert de laatste twee stappen van het biosynthetic leertraject van cafeïne11. In koffie boom zaailingen, is gebleken dat licht straling CS activiteit, wat in een toename van de biosynthese van cafeïne resulteert kan verhogen. Onlangs, toonden we dat het onderhoud van cel schorsingen van C. arabica L. onder lichte bestraling de optimale voorwaarde is voor de evaluatie van de effecten die produceren abiotische stressfactoren beïnvloeden de biosynthetic traject van cafeïne8. De informatie die is verkregen in deze studies wellicht toepassingen in de metabole engineering en systemen biologie voor het maximaliseren van de studie van de cafeïne biosynthetic pathway in dergelijke systemen in vitro .
Gezien de voordelen van het verkrijgen van een geschikt model voor de studie van cafeïne biosynthese, wij de voorwaarden van de winning voor cafeïne op cel schorsingen van C. arabica L. geoptimaliseerd Het was ook mogelijk om een nuttige protocol voor de studie van de enzymatische activiteit, evenals de methodologische stappen voor de beoordeling van het niveau van gene afschriften van Coffea cafeïne synthase 1 (CCS1) codering van dit enzym ontwikkelen. Hierin, rapporteren we een protocol voor het uitpakken en kwantificeren van cafeïne in C. arabica cel suspensies door dunne-laag chromatografie en densitometrie (TLC-densitometrie).
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij presenteren hier de optimale omstandigheden voor de evaluatie van de cafeïne inhoud, CS activiteit en afschrift niveaus in een in vitro plantaardige weefselkweek, zoals cel schorsingen van C. arabica. Eerdere verslagen hebben bevestigd dat handhaving cellen onder lichte bestraling en in aanwezigheid van theobromine in het kweekmedium geschikt parameters zijn voor het verhogen van het niveau van cafeïne, waardoor het mogelijk is om te evalueren van de cafeïne scheidingsmethoden met behulp van reve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk van onze laboratorium werd gefinancierd door een subsidie van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) SMTHS. Dit onderzoek werd ook ondersteund door een beurs toegekend aan RJPK (nr. 37938) door de CONACyT en de Sistema Nacional de Investigadores (4422). De auteurs bedanken CIATEJ voor het gebruik van zijn installaties tijdens het schrijven van dit manuscript. Speciale dank worden uitgebreid tot Dr. Víctor Manuel González Mendoza voor alle aanbevelingen in de sectie van de moleculaire biologie en Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM voor de faciliteiten tijdens het filmen van dit artikel.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O’Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
