Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

Apoptose, ou morte celular programada, é um processo fisiológico que ocorre na maioria dos organismos multicelulares e é crucial para seu desenvolvimento e homeostase¹altamente regulamentados. Além de estar envolvido na renovação celular normal e o desenvolvimento embrionário, apoptose permite a eliminação de células infectadas ou danificadas de tecidos e pode ser acionado em resposta à infecção, inflamação, câncer e também por intervenções médicas como a radioterapia ou esteroides¹. Células apoptóticas expõem “coma-me” sinais em sua superfície celular, que são reconhecidos pelos receptores em um intervalo de fagócitos profissionais e não profissionais, referidos coletivamente como “efferocytes”. Engajamento desses receptores induz a absorção e a degradação da célula apoptótica pelo efferocyte através de um processo conhecido como efferocytosis^2,3. A fosfatidilserina é o melhor caracterizadas comer-me sinal de condução efferocytosis. Normalmente é pequeno para o folheto interno da membrana plasmática, com apoptose ativando um scramblase de lipídios que interrompe esta assimetria da membrana, expondo assim a fosfatidilserina na superfície celular⁴. A fosfatidilserina é encontrada na superfície de algumas células não-apoptotic, tais como os macrófagos maduros extracelular e ativado plaquetas. No entanto, estas células não são efferocytosed devido à presença de sinais “não me coma”, tais como CD47, na sua célula superfície^5,6,7. Exposta a fosfatidilserina é reconhecida por uma matriz de receptores efferocytic expressado por efferocytes. Vinculação destes receptores de fosfatidilserina, directamente ou através da ajuda de opsoninas, ativa vias de sinalização que promovem a absorção da célula apoptótica em um vacuole membrana-limite denominado o efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. o efferosome funde-se sequencialmente com endossomos e lisossomos, que entregam a maquinaria molecular necessária acidificar o efferosome e degradar a apoptose de células carga^13,14. Uma vez degradados, os materiais de derivado de células apoptóticas são traficados para o endossomo reciclagem — um processo que limita a respostas imunes aos antígenos de apoptotic derivado de células, e que podem permitir recuperação de nutrientes do apoptose celular^{13, 15}. Uma falha no efferocytosis resulta em prejudicada afastamento de pilhas apoptotic; Estas células não compensadas eventualmente sofrem necrose secundária. Necróticas células versão pro-inflamatórios conteúdo citosólico, patógenos e auto-antigénios para o meio extracelular, assim, conduzir a uma gama de doenças infecciosas, inflamatórias e auto-imunes^16,17. Juntos, apoptose e efferocytosis facilitar a remoção de células moribundos e mortas e permitir a manutenção da homeostase do tecido.

Investigar os mecanismos moleculares subjacentes efferocytosis requer métodos que fornecem uma clara quantificação da captação de células apoptóticas. Esta quantificação é complicada pelo fato de que, ao contrário de outra absorção mecanismos como endocitose e fagocitose^18,19, efferocytosis não podem resultar no engulfment da célula-alvo intacta, tendo por resultado a absorção por etapas da célula apoptótica pelo efferocyte²⁰. O protocolo descrito neste documento descreve um em vitro ensaio de efferocytosis que fornece a delimitação exata do interiorizado versus não-internalizada porções de pilhas apoptotic individuais e pode ser combinado com uma variedade de células fixas e abordagens de microscopia de viver-pilha. Ensaios de fagocitose tradicional Acrescente os anticorpos específicos para o destino fagocitária ao final do experimento para rotular alvos não-internalizada, onde, como nosso método diferem pela rotulagem o alvo de apoptotic com biotina covalentemente ligados^{21 , 22}. enquanto os anticorpos específicos de apoptose celular podem ser usados neste ensaio, a abordagem biotinylation permite qualquer alvo de proteína-rolamento a ser rotulados e evita possíveis problemas com reactividade cruzada do anticorpo secundário se immunostaining é executada . Especificamente, descrevem a preparação de pilhas apoptotic Jurkat que foram dual-manchada com uma tintura de seguimento de célula e biotina. A célula de tintura de rastreamento permite apoptotic materiais derivados de célula a ser controlados durante a efferocytosis, Considerando que a superfície biotinylation permite a discriminação de internalizada de partes não-internalizada de pilhas apoptotic de efferocytosed. Também descrevemos a cultura e a preparação das linhas de células J774.2 e THP-1 para uso como efferocytes murino e humano, derivados de monócitos os macrófagos M2 como um exemplo de célula primária efferocytosis e células Jurkat para uso como alvos de efferocytic. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para outras linhas de célula ou células primárias, submetidos a qualquer forma de morte celular (por exemplo, apoptose, necrose e necroptosis) nas células-alvo e imita micro-empresas que simulam células apoptóticas através de revestimentos de lipídios ou revestimento com ligantes específicos a um receptor de efferocytic de interesse.

O método descrito neste protocolo tem várias vantagens sobre os métodos de fluxo cytometry baseado comumente usados no campo^23,24. Por imagem diretamente a interação da célula de fagócito-apoptotic, combinada com rotulagem clara de ambos material de célula apoptótica total e não-internalizada, medidas quantitativas de efferocytosis podem ser feitas. Além disso, o uso de pH-insensível fluorophores limita confundimento fatores tais como a supressão da fluorescência FITC e GFP no pH dos lisossomos que confunde alguns métodos alternativos de²⁵. Por último, embora não descrito em detalhe, esses métodos podem ser empregados usando efferocytes expressar transgenes fluorescente-etiquetadas, ou com pós-fixação imunocoloração, para permitir a quantificação da atividade da molécula de sinalização e controlo da processos celulares durante efferocytosis.