ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション アッセイについて述べる。手動でまたは自動的に実行できます、アッセイは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および組織のコンテキスト内での突然変異の可視化を有効にできます。
精密医学はバイオ マーカーの検出に依存、ので RNA バイオ マーカー測定現場で臨床検体で標準化された、堅牢なテクノロジが必要になってあります。挽くとバインドの試金のように RNAseq、定量的 RT-PCR 高感度遺伝子発現測定を有効にする、彼らはまた RNA の抽出を必要とする、形態の組織コンテキスト内で貴重な発現解析を防ぐため。ここで説明したその場で交配 (っぽい) のアッセイは、50 のヌクレオチド塩基の分解能で、単一セルのレベルの短い RNA ターゲット シーケンスを検出できます。この試金は開発済みの商業分析を補完するもの、スプライスバリアント、短いターゲット、および組織内の点突然変異の高感度および特定の in situ検出。このプロトコルでは、プローブは、EGFRvIII と METΔ14 2 つの臨床的に重要なスプライスバリアントのユニークなエキソン接合をターゲットに設計されていた。短いターゲット シーケンスの検出は、T 細胞受容体 α および Jurkat T 細胞株における β の CDR3 シーケンスの特定の検出によって示されました。また、細胞を用いた自動染色の EGFR L858R KRAS G12A 単一ヌクレオチド変化の可視化による単一ヌクレオチド分解能 (点突然変異) RNA ターゲット シーケンスの区別のためこのっぽいアッセイの有用性プラットフォーム。要約すると、プロトコルは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および突然変異の in situ手動によるパフォーマンスと自動方向づけるの検出を可能にする特殊な RNA っぽい試金を示しています。
マイクロ アレイや次世代の RNA シーケンス (RNAseq) などの高スループット トランスクリプトーム技術は指数関数的になど様々 な疾患の診断、予後、および予測の臨床的価値を持つ RNA バイオ マーカーの発見を改善しています。がん1,2。精密医学におけるこれらのバイオ マーカーの使用を事前には、高い臨床サンプルの組織コンテキスト内で RNA バイオ マーカーを測定することができます標準で堅牢な技術の必要性。必要な組織の均質化と RNA の隔離が体内細胞型特異性の損失を意味しながら広く確立される RNAseq など定量的 RT-PCR を挽くとバインド アッセイは、高感度遺伝子発現測定を有効にすると、形態素情報3。感度と特異度の組織コンテキスト4内希少または低発現 RNA バイオ マーカーを確実に測定するために必要な従来の in situ RNA 検出の方法論を欠いています。
商業の in situハイブリダイゼーション (っぽい) アッセイ (e.g、RNAscope 試金) はこれらに取り組んできた 1 つの技術課題とも 300 を超える単一の RNA 分子の高感度・特定の可視化を実現。組織形態学的文脈の中でのヌクレオチド。このタイプの試金は、約 6-20 ダブル Z プローブ ペア交配ベースの高度な信号増幅5と組み合わせてのユニークなオリゴヌクレオチド プローブ デザインを使用しています。
本研究では、特殊な RNA っぽい試金、BaseScope、50 のヌクレオチド塩基の分解能で短い RNA ターゲット シーケンスを検出する以前にデザインされた商業技術を補完するものをについて説明します。この試金はトランスクリプトームの複雑な複雑さに対処、エキソン接合、短いターゲット シーケンス、およびわずか 1 ダブル Z プローブ ペアを使用して、組織コンテキスト (表 1) に点突然変異の正確な検出を適用されます。FFPE の単一塩基配列変異細胞ラインおよび腫瘍組織とこのレポートは完全な試金のプロトコル、スプライスバリアント、T 細胞受容体クローンの CDR3 シーケンスの検出での使用を示します。
このレポートで詳しく小説っぽいの試金のプロトコルとその応用を論じた。アッセイは、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および組織のコンテキストにおける点変異の直接可視化が可能です。アッセイは、RNAscope 技術5に基づいており、したがって単一分子検出が可能です。ただし、高度な増幅方式により信号を検出プローブとしてはほとんど 1 つのダブル Z のペアを含む、ちょうど 50 のヌクレオチドのターゲット テンプレートの長さできます。プローブ長さシングル ダブル Z として短いことがあるのでこれにより、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および点突然変異 (表 1) の検出のため。
アッセイの成功したパフォーマンスのいくつかの技術的な推奨事項があります。まず、組織は、室温 16-32 h10新鮮な 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) で修正されるはず。Underfixation ( 32 h) アッセイのパフォーマンスが低下し、さらなる最適化が必要な場合があります。第二が堅牢なプローブの交配および信号の増幅に必要な温度と湿度、最適にコントロールする処理システム、ハイブリダイゼーション オーブン スライドに使用するプロトコルの手順 5 に 2.3 (プロテアーゼ前処理、プローブ交配、信号増幅、および信号検出)。第三に、過剰な残留バッファーは、プロトコルを通して各ステップの前に正しくデカントし (しかしないなので、組織切片が乾く) にする必要があります。スライドが乾く場合重要な非固有の信号を開発します。第四に、組織の種類に応じて、前処理の最適化は必要かもしれません。間違ってプロテアーゼを使用してまたは時間の最適な長さの実行可能性の下で- またはオーバー-digestion と信号に悪影響を及ぼします。最後に、常にテスト プローブで正と負のコントロールを実行することが重要です。陰性コントロール プローブには、サンプルの RNA の品質はプローブのテスト結果を解釈するために最適であると、バック グラウンド信号がないポジティブ コントロール プローブは、測定が正しく行われていることを確認を確認します。信号がないポジティブ コントロール プローブと、サンプルの RNA の品質が最適ではない場合、テスト プローブを信号が表示されません。
手動測定に加えて自動方向づけるでアッセイを行う機能はまた実証 (図 6) であります。この自動っぽい試金高い信号対雑音比が得られ表 1で示すように、同様のアプリケーションに適用可能なただし、自動化されたアッセイの利点はアッセイ条件, ユーザ間の変動性と実践的な時間の最小化の標準化、信頼性の高い方法で組織サンプルの高スループット スクリーニングのための手当します。
免疫組織染色 (IHC) および qRT PCR FFPE 臨床検体におけるスプライス変異 (特に EGFRvIII) の検出を可能にする、これらのテクニック不足することは必要な特異性、スプライスの空間分解能への洞察力を提供していません。バリアント型の式は、それぞれ11,12。このプロトコルのアッセイの主な利点はその高感度・特定の可視化スプライス接合形態の組織コンテキストを維持しながら。ここでは、EGFRvIII と METΔ14 を含むいくつかのスプライスバリアントのユニークなエキソン接合を正確にターゲットにアッセイの能力が実証 (図 3 および 6)。さらに、前立腺癌、脳で ErbB4 の複数のアイソ フォームとマウス脳3,13,14の円形の RNA Cdr1as のノックアウトの確認のスプライスバリアント AR V7 を検出するアッセイを示されています。
Jurkat 細胞 (図 3) 由来 CDR3 シーケンスの検出によって示されているようにこの ISH 法による短いターゲット シーケンスの検出できます限り短く、長さ 50 のヌクレオチド RNA シーケンスの可視化。アッセイは、Revêchonらが示すように、他の家族のメンバーまたは種と高い相同性は遺伝子の塩基配列を検出することも。、マウス皮下白色脂肪15で表される人間の progerin を検出する短いターゲット試金を使用しました。さらに、小さな核小体 RNA (snoRNA)、CRISPR 媒介性遺伝子の編集、および前駆体マイクロ Rna 検出されたその場で短いターゲット分析をすることができます。最近では、Fu et al.は、プレ-マイクロ Rna mir125b16を表現する網膜の精密な細胞を識別するために IHC とこのっぽいアッセイを組み合わせます。
腫瘍におけるプロファイリングの突然変異は腫瘍の進行を勉強するため、目標とされた療法を開発するために重要です。変異プロファイルは、高スループット シーケンスを介して達成することができます、一方この技術は腫瘍細胞形態17,18の不均一性やリンクの遺伝子変異を十分に対応できません。このっぽいアッセイを用いた点突然変異の検出は、単一ベース解像度、細胞 (図 5) の EGFR L858R KRAS G12A 単一のヌクレオチド変化の検出による検証として RNA ターゲット シーケンスの区別のためことができます。さらに、ベイカーらは、大腸癌18PIK3CA、KRAS, BRAF 遺伝子に複数の変異を対象とするのに点突然変異の試金を使用しました。識別し、最終的に内腫瘍の多様性に貢献する方法を示す腫瘍細胞のまれな変異サブクローンを空間的にマッピングすることができました。
要約すると、特殊な RNA っぽいアッセイを開発しました。この手法は、スプライスバリアント、短いシーケンス、およびその場で突然変異の検出のためことができます。マニュアルの方法と自動方向づけるの両方のパフォーマンスに敏感な特定、定量化、および適応です。
The authors have nothing to disclose.
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) | ACD | 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II) | |
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) | ACD | 310012 | |
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 | ACD | 310017 | |
HybEZ Humidifying Paper | ACD | 310015 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required) | Vector Laboratory | H-4000 | |
SuperFrost Plus Slides (required) | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
10% neutral-buffered formalin (NBF) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paraffin wax | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microtome | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific/MLS | HXGHE1LT | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Xylene | Fisher Scientific/MLS | X3P-1GAL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack | American Master Tech Scientific/MLS | LWSRA24 | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Staining Dishes | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4457EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant | American Master Tech Scientific/MLS | LWT4456EA | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
100% alcohol (EtOH) | American Master Tech Scientific/MLS | ALREACS | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) | Vector Labs | H-5000 | |
Cover Glass, 24 x 50 mm | Fisher Scientific/MLS | 12-545-F | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Ammonium hydroxide, 28–30% | Sigma-Aldrich/MLS | 320145-500mL | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Carboy (>3L) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer | / | / | |
Digital thermometer | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Pipettors and tips, 1–1000 μL | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Distilled water | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Tubes (various sizes) | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Fume hood | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Graduated cylinder | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Parafilm | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Paper towel or absorbent paper | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microcentrifuge | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Microscope and accessories | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1°C | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Formaldehyde | MLS | / | MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier. |
Histogel | Fisher Scientific/MLS | 22-110-678 | |
BaseScope Reagent Kit – RED | Advanced Cell Diagnostics | 322900 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 | Advanced Cell Diagnostics | 701701 | |
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701711 | |
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 | Advanced Cell Diagnostics | 701721 | |
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 | Advanced Cell Diagnostics | 701731 | |
BaseScope Hs-MET-E14E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701811 | |
BaseScope Hs-MET-E13E15 | Advanced Cell Diagnostics | 701801 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12A | Advanced Cell Diagnostics | 705491 | |
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT | Advanced Cell Diagnostics | 705531 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858R | Advanced Cell Diagnostics | 705451 | |
BaseScope Hs-EGFR-L858WT | Advanced Cell Diagnostics | 705461 | |
BaseScope Control Probe Pack Human | Advanced Cell Diagnostics | 322975 |