Ein High-Throughput Cre-Lox aktiviert virale Membran Fusion Assay Ermittlung Inhibitoren der HIV-1 Virus Membranfusion
Summary
Wir beschreiben eine zellbasierte Assays auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck von grün fluoreszierendes Protein nachweisbar durch Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie melden. Es kann verwendet werden, Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen.
Abstract
Dieser Test soll speziell auf HIV-1 Fusion über den Ausdruck des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) nachweisbar Berichten von Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Eine HIV-1-Reporter-Virus (HIV-1-Gag-iCre) entsteht durch das HIV-1-Genom zwischen der Matrix und die Kapsid-Proteine der Gag funkionalen Cre-Rekombinase einfügen. Dies führt zu einer Verpackung der Cre-Rekombinase in Viruspartikel, die dann in einer Zielzelle freigesetzt wird Linie stabil ein Cre Rekombinase aktiviert rot fluoreszierenden Proteins (RFP) zur GFP-Schalter-Kassette zum Ausdruck zu bringen. In den basalen Zustand drückt diese Kassette nur RFP. Im Anschluss an die Übergabe der Cre-Rekombinase in die Zielzelle oder beschneidet RFP, flankiert von LoxP-Websites, wodurch GFP Ausdruck. Dieser Test kann verwendet werden, um Inhibitoren der viralen Eintrag (speziell bei der Fusion Schritt) in zellfreien und Zell-Zell-Infektion Systeme zu testen und wurde verwendet, um eine Klasse von Purinergic-Rezeptor-Antagonisten als neuartige virale Membranfusion HIV-1-Hemmer zu identifizieren.
Introduction
Die Notwendigkeit einer neuen antiretroviralen Therapien veranlasste die Entwicklung von Hochdurchsatz-Bildschirme für Inhibitoren der HIV-1 Eintrag. Die Gag-iCre Reporter Assay wurde entwickelt, um Inhibitoren der viralen Eintrag bei der Fusion Schritt in einem System von Zelle zu Zelle Infektion zu identifizieren, durch speziell virale Membranfusion mit dem Host Zellmembran1messen. Ein Test wurde entwickelt, um Bildschirm für neuartige Hemmstoffe, die speziell auf den frühen Stadien der HIV-1-Infektion bis zu dem Punkt der viralen Membranfusion gehandelt. Eine Herausforderung für die Messung der Zell-Zell-Infektion ist, dass das anfängliche Inokulum enthält infizierten Spenderzellen und ininfected Zielzellen, so Neuinfektionen zu messen schwierig ist, von der Eingabezellen unterscheiden. Das ideale System würde bedeuten, eine Heterologe gen-Markierung, die durch die Einleitung einer Ziel-Zelle-Infektion verursacht werden kann und in der Spender Zelle ist nicht vorhanden. Eine beliebte virale Inhalte mischen Assay basiert auf einer viralen Protein-Enzym-Fusion, BlaM-Vpr, wirksam sein können, aber hat seine Grenzen für hohen Durchsatz, Zell-Zell-Screening-2. Dieser Test beinhaltet eine Beta-Lactamase (BlaM) Reporter-gen, die mit HIV-1 Vpr verschmolzen, in Virionen verpackt und geliefert in Zielzellen auf virale Membranfusion. Das Substrat CCF2-AM wird in das Zytoplasma der Zielzellen geladen und eine Fluoreszenz Veränderung bei der Spaltung. Das CCF2-AM Substrat ist teuer und unerschwinglich für Hochdurchsatz-Bildschirme werden kann. Um Spender und Ziel-Zellen zu unterscheiden, ist es notwendig, Farbstoff-Label der Zielgruppen. Schließlich erfordert das Protokoll mehrere Wasch- und Inkubation Schritte, die aufwändig und kostspielig sein können, wenn große Anzahl von Verbindungen zu testen.
Die Gag-iCre Assay entwickelte sich als eine Lösung für diese Probleme eine Hochdurchsatz-screening für Inhibitoren der Fusion in Zell-Zell-Übertragung zu entwickeln. Dieses System erfordert keine Substrat in Zellen geladen werden. Der Test eignet sich auch für zellfreie Studien und ist anpassungsfähig an andere virale Fusion Studien mit Pseudo-typisierte HIV-1-Gag-iCre Viruspartikel. HIV Env vermittelte Zell-Zell-Fusion-Assays können Virus Env Protein-vermittelte Zellfusion, Messen, aber diese nicht tatsächliche Viruspartikel benutzen, ebenso wie die Gag-iCre HIV-1-Assay3,4,5. Dieser Test kann mit Flow-zytometrie oder Fluoreszenz-Mikroskopie gelesen werden. Es wird erfolgreich eingesetzt, die FDA-Bibliothek sowie eine kleine Bibliothek von Purinergic Inhibitoren1,6auf den Bildschirm. Andere Forscher identifizierten auch Purinergic Inhibitoren in HIV-1 Fusion mit eine angepasste und optimierte Hochdurchsatz-Fusion-Assay, der berichtet die Übertragung des Virus-gekapselte Beta-Lactamase in das Zytoplasma7,8 .
Die Gag-iCre-Virus wurde mit einem ähnlichen Ansatz für das Einfügen von Cre-Rekombinase zwischen Matrix und Kapsid, flankiert von HIV-1 Protease Seiten9Gag-iGFP-Virus entwickelt. Das Cre-Enzym erfolgt als Vorläufer innerhalb der Gag-funkionalen, die reift bei HIV-1 Protease innerhalb der im Entstehen begriffenen Viruspartikel aktivierter eingefügt. Die Cre-Lieferung ist somit abhängig von der Lieferung der Inhalte von HIV-1 Protease-aktivierten Teilchen in ein Ziel Zelle über eine virale Membran Fusionsprozess. Zwei Versionen des Protokolls stehen hier zur Verfügung. Die erste verwendet eine Bevölkerung von HIV-1 infizierten Zielzellen, zur Untersuchung der direkten Zell-Zell-Übertragung von HIV zu infizieren. Die zweite Version verwendet einen zellfreie Virus eine zellfreie Virusinfektion zu studieren. Der Zell-Zell-Übertragung-Test dauert 7 Tage ab dem Tag abgeschlossen, die die Zellen aufgetaut sind, oder 5 Tage, wenn die Zellen bereits aufgetaut und passagiert sind. Zellfreie Infektion Assay kann in 5 Tagen, wenn die Zellen müssen aufgetaut werden und 3 Tage durchgeführt werden, wenn die Zellen aufgetaut und passagiert sind. Anweisungen sind auch generieren eine RG (rot, grün) Ziel-Zelllinie in der gewünschten Zelltyp (wenn eine bereits vorhandene RG-Ziel-Zelllinie nicht verwendet wird) mit einem Plasmid von Clevers Lab10erstellt. Es wird empfohlen, entsprechende biologische Sicherheitsvorkehrungen, mit dem Virus und der Virus exprimierenden Zellen in diesem Test getroffen werden. Wir führen die infektiöse Teil des Assays in einer Gewebekultur Einrichtung BSL2 +. Nachdem die Zellen fixiert sind, können sie im standard Flow Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen analysiert werden.
Hier beschreiben wir die Anwendung des Assays auf Bildschirm für Roman Verbindungen hemmen HIV-1 Virus Membranfusion (Abbildung 1). Purinergic Rezeptoren sind Pro-inflammatorischen Mediatoren. Unser Labor hat gezeigt, dass nicht-selektive Inhibitoren der Purinergic Rezeptoren als Inhibitoren von HIV-1 virale Membran Fusion6handeln. Wir berichten, dass die Nutzung des Assays in hohem Durchsatz Roman HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren identifizieren kann. Wir zeigen, dass ein Inhibitor der Purinergic Klasse Rezeptoren eine neuartige Klasse von HIV-1 virale Membran Fusion Inhibitoren darstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Gag-iCre Assay erweist sich als sehr nützlich für das screening von Medikamenten-Kandidaten, die die Fusion Schritt der Virusreplikation hemmen können. Wenn Sie diesen Test durchführen, sind die wichtigsten Schritte, um ein gutes Signal ähnlich wie die meisten viralen Infektion Assays. Der erste wichtige Schritt ist hohe Titer von guter Qualität Virus produziert. Dieser Schritt erfordert, dass die 293T Zellen passagiert häufig (mindestens 1 x alle 48 Std.), so dass sie nicht Overconfluent zu werden und verklum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse des NIH/NIAID AI112423 und NIH/NIGMS GM113885, Benjamin K. Chen und NIH/NIAID K08-AI120806, Talia H. Swartz. Wir möchten der Icahn School of Medicine am Mount Sinai Dean Flow Cytometry Kern zu danken.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma Aldrich | D5546 | Media for 293 Cells |
| RPMI-1640 | Sigma Aldrich | R0883 | Media for Jurkats |
| Fetal Bovine Serum Albumin | Gibco | 16140-071 | Serum for 293 Cells |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.03 | Serum for Jurkat Cells |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | Penn/Strep used in both media |
| T75 Flasks | Corning | 3073 | Used for Culture of Jurkat Cells |
| 10cm Tissue Culture Plates | Corning | 430167 | Used for Culture of 293 Cells |
| 96 Well Plates (tissue culture Treated) | Corning | 3595 | Used for fusion assay |
| Polyjet Transfection Reagent | Signagen | SL100688 | Used to transfect 293 Cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-100ML | Used in wash steps |
| Hyclone Trypsin Protease | GE Healthcare Life sciences | SH30042.01 | For Trypsinization of 293 cells |
| Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | For Nucleofection of Jurkats |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare Life sciences | 17144002 | For Nucleofection of Jurkats |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | For all tissue culture |
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | For all tissue culture and liquid handling steps |
| Millex Syringe Filter (0.45 micron) | Millipore | SLHA033 | For filtration of virus |
| BD Slip Tip Sterile syringes | BD Diagnostics | 309656 | For filtration of virus |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | 2b | for Nucleofection of Jurkats (various models available) |
| BD Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | for flow cytometry analyss of samples | |
| Tissue Culture Hood | Various models | Fortessa 2 | |
| pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE | Addgene | 32702 | Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011). |
| pCL10a1 | Novus Bio | NBP2-29542 | Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996) |
| Gag-iCre | Benjamin Chen Lab | Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016). |
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