ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6
Summary
מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.
Abstract
שתלי שבלול (CIs) הם התקנים neuroprosthetic יכול לספק חוש שמיעה אנשים חרשים. עם זאת, מודיע אין אפשרות לשחזר כל ההיבטים של השמיעה. שיפור הטכנולוגיה השתל נדרש אם משתמשים CI הם תופסים את המוסיקה ולבצע בסביבות טבעי יותר, כמו לשמוע את קול עם מתחרות דברנים, השתקפויות של צלילים אחרים. שיפור כזה דורש חיות ניסוי כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של גירוי חשמלי ב שבלול, התגובות במערכת השמיעה לגמרי. העכבר הוא מודל אטרקטיבי יותר ויותר בגלל הדגמים גנטיים רבים זמינים. עם זאת, שימוש מוגבל של מין זה כמודל CI הוא בעיקר בשל הקושי של השתלת אלקטרודה קטנה מערכים. פרטים נוספים אודות הליך כירורגי ולכן הם עניין רב להרחיב את השימוש של עכברים במחקר CI.
בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה ב המתח העכבר C57BL/6. אנו מדגימים את היעילות פונקציונלי של הליך זה עם תגובה חשמלית עורר גזע המוח (eABR), להראות דוגמאות של גירוי עצב הפנים. לבסוף, נדון גם את החשיבות של לרבות הליך מחרישת אוזניים בעת שימוש שימוע בדרך כלל בעלי חיים. מודל העכבר זה מספק הזדמנות חזקה כדי לחקור מנגנונים גנטיים ולא הנוירוביולוגי שיהיו רלוונטיות למשתמשים CI.
Introduction
שתלי שבלול (CIs) הם התקנים אלקטרוניים יכול לספק חוש שמיעה לאנשים עם אובדן שמיעה חמור ועמוק. היא משתמשת אלקטרודות שהושתל בניתוח שבלול האוזן הפנימית כדי ישירות לגרות את עצב השמיעה. עד היום, המודיע הוא הפרוטזה חושית המצליחות ו עזר יותר מ 600,000 אנשים ברחבי העולם1. עם זאת, למכשיר יש חסרונות. קודם כל, היתרונות המסופקים על ידי המכשיר להשתנות במידה רבה בקרב הנמענים. שנית, דיבור סביבות רעש ומוסיקה עדיין גרוע נתפסים על ידי רוב המשתמשים CI.
במשך שנים רבות, חייתיים שימשו כדי להבין טוב יותר בעיות אלה במחקר CI וכדי לשפר את הבטיחות והיעילות של המכשירים. הדגמים נותן ערך תובנה מספר תופעות, כמו פלסטיק שינויים במוח המתרחשים בעקבות ההשתלה CI2, ההשפעה של טיפול גנטי כדי לשמר את מבחן3ולמאפיינים ביופיזיקלי של החלת עצב השמיעה מגורה חשמלית4, בין דוגמאות רבות אחרות.
עכברים הם אורגניזם מודל חזק בשל הזמינות גדול של דגמים גנטיים של חירשות. יתרונות נוספים כוללים את היכולת לתפעל את הגנום העכבר (למשל, באמצעות מערכת CRISPR-Cas), ההזדמנות להשתמש הדמיה טכניקות ללמוד מנגנונים, במיוחד באזור המוח, רבייה גבוהה קצב התפתחות מהירה מתקדמות, קל לגידול וטיפול. האתגרים הטכניים העיקריים בביצוע ניתוחים CI בעכברים הם גודלו הקטן של שבלול הנוכחות של עורק גדול stapedial (SA). ה-SA בדרך כלל נעלם במהלך התפתחות בבני אדם אך נמשכת לאורך החיים במספר של מכרסמים, לרבות עכברים, חולדות, גרבילים. ה-SA פועל מתחת הנישה החלון העגול, אשר מסבך את הגישה שבלול ומגבירה את הסיכון כירורגי.
מחקרים קודמים הראו את הכדאיות של CI השרשה ב עכברים5,6,7. אירווינג ואח הוכיח כי גירוי חשמלי intracochlear כרונית יכולה להיות מושגת עד לחודש אחד. גירוי אקוטי גם בוצעה אך ההקלטות לא הוצגו. הם הראו כי cauterizing את העורק stapedial היה אין השפעה משמעותית על סף שמיעה או מספר הנוירונים גנגליון ספירלה וכי יישום מקומי של neomycin aminoglycoside, תרופה ototoxic, היה מחריש אוזניים הליך יעיל ב עכברים5. Soken ואח תיאר גישה הגבי ששונה כדי שבלול העכבר מבעד לחלון העגול כדי כדאי לשמר את מצב השמיעה6. בעקבות החדרת מכשיר האזנה פלטינה-אירידיום, מבחן משמעותי נצפתה עם מענה גזע המוח מוגברת (ABR) סף 28 dB. פליטת Otoacoustic (OAE) אבדו בבעלי חיים עם גדול ABR הסף משמרות6. Mistry et al. נבדקו ההשפעות histopathological פונקציונלי של ההשתלה בהיעדר גירוי חשמלי7. אף-על-פי שמיעה השתמרו בעכברים 3 עד 6 חודשים מושתל בתדרים נמוכים, השרשה גרם רקמה דמוית פיברוזיס סביב השתל, osteoneogenesis סביב bullostomy7.
בקיצור, מתוך המחקרים שלוש ב- CIs בעכברים, רק אחד מדגים הקלטה פונקציונלי של גירוי CI. אירווינג ועמיתיו ביצע שתי הקלטות אקוטי וכרוני eABR אבל רק הראו נתונים גירוי כרוני של CI5. עם זאת, הדגם כרונית עם מכשיר מושתלת לחלוטין שפותחה על ידי אירווינג et al. הוא טכנית מאתגר. עדיין לא ידוע אם גירוי CI חריפה, הן פחות מאתגר ומהיר, ניתן להשיג תוצאות דומות.
CIs נמצאים בשימוש על ידי אנשים עם אובדן שמיעה חמור ועמוק, הנהנים כבר לא מכשירי שמיעה. מודלים עבור משתמשים CI ולכן צריך לכלול הליך מחרישת אוזניים בדרך כלל בדיון בעלי חיים משמשים. סיבה נוספת כדי להחריש שמיעה בעלי חיים היא כי גירוי חשמלי של חרשים או שמיעה שבלול מייצרת תגובות עצביות שונות4,8,9,10,11, 12. גירוי חשמלי של שבלול חירש מפעילה את סיבי עצב השמיעה ישירות ומייצר מענה electroneural (α). הוא מאופיין על-ידי השהיית קצר טווח דינמי קטן8,הפריפריה10. מצד שני, גירוי חשמלי של שבלול שמיעה מרגש גם תאי השיער, בתגובה electrophonic (β) המאופיינת יותר זמן השהיות ארוכות יותר, טווח דינמי גדול4,11. התגובה electrophonic מיוחסת עירור נורמלי של סיבי עצב על ידי תאים שיער הפנימי, התכווצות המושרה חשמלית של תאים שיער החיצוני, דור של גל נוסע4. תגובות Electroneural ו- electrophonic גם תוצאה של שני דפוסי פעילות שונה ב מערכת העצבים המרכזית9. סאטו ואח הקליט הניריונים המוח האמצעי של שפן CI מושתל לפני ואחרי מחריש אוזניים עם neomycin, מה שמבטל את התרומה electrophonic. הם הראו כי השיפוע של הפונקציה rate ברמת היה תלול יותר, ירי המחירים גבוהים יותר בתנאי deafened לעומת מצב השמיעה9. לפיכך, בהתאם שאלת המחקר כאמור, חשוב לקחת בחשבון כולל מחריש אוזניים electrophonic נפרדים, electroneural תגובות על גירוי חשמלי של עצב השמיעה.
כאן, אנו מתארים הליך מחריש אוזניים חריפה, ההשתלה שבלול של מערך אלקטרודה ב עכבר, כמו גם את ההקלטה פונקציונלי של גירוי חשמלי intracochlear עם תגובה חשמלית עורר גזע המוח (eABR).
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר את הגישה כירורגי מחריש אוזניים חריפה, השרשה שבלולי העכבר, כמו גם את הערכת תפקודי של CI גירוי עם גזע המוח השמיעתית תגובה. למרות שבלול העכבר הקטן ואת הניתוח מאתגר, המודל העכבר CI הוא ריאלי, והוא משמש כלי חשוב במחקר שמיעתי.
עורק stapedial נוכחת האוזן התיכונה של העכבר. העורק מזין את בולה אחוריים-medially, ונוסע נלסון אל הנישה החלון העגול ולאחר מכן עליונית הנישה החלון הסגלגל. בפיתוח ראשוני של דגם העכבר, שחווינו קטלנית טראומה הבאים אינטרה-פעיל דימום העורק stapedial, בעיקר בעת גישה של בועה. כתוצאה מכך, אנחנו הותאם גישה מוגבלת יותר ולגשת אליהם את בולה בשלבים לנתיחה קטנה, המעודנת. אין סיבוכים נוספים עקב דימום לאחר מכן נצפו. למרות העובדה שהחריצה עורק stapedial הזה יש השפעה משמעותית על סף שמיעה או מספר הנוירונים גנגליון ספירלה עכברים5, לדעתנו, זה מיותר כל עוד תשומת לב ודאגה עצומים נלקחים במהלך הניתוח. אנו ממליצים לקחת את הזמן הדרוש כדי לפתח מיומנויות psychomotor בסדר, השג מיומנות טכנית. הזמן הממוצע של החתך הראשוני לסגר סביב האלקטרודות מושתל היא בדרך כלל 1-1.5 שעות.
הניתוח מתואר CI חריפה בעכברים דומה הליך “הגחון” ואת חלון עגול ההכנסה שימוש מכרסמים אחרים, כולל עכברושים, גרבילים20,21,22. מחקרים מכרסמים אחרים ניצלו את “הגישה הגבי” עם cochleostomy התור הבזליים במקום הכניסה חלון עגול, הימנעות SA לחלוטין ולהוספה של המערך יותר עמוקות6,23,24. ההשתלה של אסיפה גירוי כרוני בעכברים עוקב אחר הפעולות כפי שמתואר פרוטוקול זה עם התוספת של רשת שדקרון לתקן את השתל ואת הטיפול לאחר הניתוח5.
האתגרים הטכניים הראשי בעת ביצוע ניתוחים CI בעכברים הם גודלו הקטן של שבלול בהשוואה שבלול של חולדות, גרבילים, ואת נוכחותם של SA גדולים. ה-SA קיים גם בחולדות אבל לא בתוך גרבילים. בנוסף, מאז עכברים קטנים יותר חולדות, גרבילים, הם פגיעים יותר ניתוחים.
כדי למנוע electrophonic תגובות ב eABR הקלטות ומחקות איבוד תאים שיער נמצאו רוב המשתמשים CI, אנחנו deafened את בעלי החיים לפני ההוספה CI. עכברים הם קשה כדי להחריש ototoxically ויוו25 כי ריכוזי aminoglycosides הנדרש כדי לגרום ototoxicity מערכתית יש חלון צר מינון: להוריד מינונים בהתחשב במשך מספר ימים תוצאות אין הפסד תא שיער ואילו זריקה אחת מינון גבוה יותר יכול להיות קטלני26. גם, הרגישות aminoglycosides הוא זן התלויים26. עם זאת, הוכח כי מנה אחת של aminoglycosides בשילוב עם חומר משתן לולאה יכול לייצר תא שיער החיצוני מוגזמת אובדן בעכברים כקבוצת/CaJ ללא השלכות קטלניות27. מוות מושהה תאי שיער הפנימי דווח לחצי cochleae בחן כל27.
כתב יד זה, השתמשנו יישום מקומי של neomycin aminoglycosides בהשראת פרוטוקול הוקמה לאחרונה עבור עכברים C57BL/65. יישום חריפה של neomycin גדל באופן משמעותי את סף השמיעה עורר לחץ 46 dB ± 6.1. למרות עלייה זו הוא גדול יותר מאשר העלייה 35 dB שדווחו על ידי אירווינג. et al. (לעומת טרום הניתוח: 41.6 dB ± 3.3 לעומת 76.6 dB ± 4.4, p = 0.02, n = 3) 5, שהשגנו הסף באותו פוסט מחרישת אוזניים (75.7 dB ± 3.7 לעומת 76.6 dB ± 4.4). neomycin 0.05% נחשב לגרום לאובדן שמיעה, בעיקר על ידי מוות תאים שיער החיצוני מהירה, חלקית כמו איבוד תאים שיער הפנימי לוקח יותר זמן להתרחש27. לכן אפשרי התגובה electrophonic, אשר הוא שנוצר הן על ידי הפנימי, החיצוני תאים שיער4,8,9,10,11,12, הוא רק חלקית חוסל ב deafened בעלי חיים עם מבחן. למרות neomycin 0.05% (משקל/נפח) לא להקטין את מספר הנוירונים גנגליון ספירלה 4 שבועות שלאחר מחריש אוזניים5, זה כבר ידוע אם neomycin בהגדרת חריפה שלנו משפיעה על סיבי עצב השמיעה או מקדם synaptopathy (אובדן הסינפסות בין תאים שיער פנימי סוג אני השמיעה עצבים סיבים). וודאות נוספת היא כי הטיפול neomycin אקטואלי לייצר התפלגות אחידה של נשירת שיער התא לאורכו של שבלול. מחקרים עתידיים נדרשים לענות על שאלות אלה.
לסיכום, המספר הגדל והולך של דגמים גנטיים חירשות האנושית ואת הכלים הביוכימי הזמינים הפוך את העכבר במודל חיה אטרקטיבי למחקר השמיעתי, לרבות בתחום של חבר העמים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות פייר שטל, Oticon רפואי, בניס, צרפת, למתן את החיה גירוי פלטפורמה וייעוץ על גירויים פרדיגמות, ו פאלון B. ג’יימס אנדרו ק’ וייז ממוסד שטני, מלבורן, אוסטרליה, לקבלת ייעוץ כירורגי . עבודה זו נתמכה על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (ERC מענק העברה T.R.B.).
Materials
| Hardware | |||
| Sound-proof booth | IAC Acoustics, Winchester, UK | Mac-2 Enclosure RF Shielded Box 2A | |
| MF1 Speaker | Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA | ||
| PCB microphone | PCB Piezotronics, Inc, NY, USA | Model 378C01 | |
| Low impedance headstage | TDT, FL, USA | RA4LI | |
| Medusa pre-amplifier | TDT, FL, USA | RA4PA | |
| RZ6 auditory processor | TDT, FL, USA | ||
| Animal Stimulator Platform | ASP, Oticon Medical, Nice, France | ||
| Multimeter | Fluks | #115 | |
| Surgical equipment | |||
| Closed-loop heating pad | FHC, Inc. ME, USA | ||
| Eye ointment | Alcon, CH | Lacrinorm Augengel | |
| Acoustic foam | Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH | #464 | |
| Disposable subdermal needle electrodes | Horizon, Rochester Electro-Medical Inc. | S83018-R9, 27G | |
| Self-retaining retractor tool (Mini Collibri Retractor) | Fine Science Tools | #17000-01 | |
| Suction wedges | Agnthos, SE | #42-886-460 | |
| Absorbable paper point (Medium) | WPI, FL, USA | #504182 | |
| Intracochlear electrode array | Bionics Institute, Melbourne, Australia | 4 channel | |
| Spongostan Standard | Ferrosan Medical Devices | #MS0002 | |
| Tissue glue. Loctite 4161 Superbond | Henkel | Part No 19743 | |
| Animal Stimulator Platform (ASP) | Oticon Medical, Nice, France | ||
| Drugs/chemicals | |||
| Ketamine (Narketan) | Provet AG, CH | 100mg/mL, #VQ_320265 | |
| Xylazine (Rompun) | Provet AG, CH | Inj Diss 2%, # 1315 | |
| Bupivacaine | Compendium, CH | Bupivacain Sintetica inj Diss 0.5% | |
| Atropine (Atropinesulfat Amino) | Amino AG, CH | 1 mg/ml | |
| Betadine (Povidone/iodine) | Provedic, CH | ||
| Neomycin (Neomycin trisulfate salt) | Sigma | N1876-25G, Lot#WXBB7516V | |
| Software | |||
| BioSigRZ | TDT, FL, USA | ||
| Matlab | MathWorks, MA, USA | ||
| ASP software | Oticon Medical, Nice, France |
References
- The-Ear-Foundation. . Cochlear Implants Update. , (2018).
- Fallon, J. B., Irvine, D. R. F., Shepherd, R. K. Cochlear Implants and Brain Plasticity. Hearing Research. 238 (1-2), 110-111 (2008).
- Pfingst, B. E., et al. Neurotrophin Gene Therapy in Deafened Ears with Cochlear Implants: Long-term Effects on Nerve Survival and Functional Measures. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (6), 731-750 (2017).
- Miller, C. A., et al. Electrical excitation of the acoustically sensitive auditory nerve: single-fiber responses to electric pulse trains. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 7 (3), 195-210 (2006).
- Irving, S., et al. Cochlear implantation for chronic electrical stimulation in the mouse. Hearing Research. 306, 37-45 (2013).
- Soken, H., et al. Mouse cochleostomy: a minimally invasive dorsal approach for modeling cochlear implantation. Laryngoscope. 123 (12), E109-E115 (2013).
- Mistry, N., Nolan, L. S., Saeed, S. R., Forge, A., Taylor, R. R. Cochlear implantation in the mouse via the round window: effects of array insertion. Hearing Research. 312, 81-90 (2014).
- Hartmann, R., Topp, G., Klinke, R. Discharge patterns of cat primary auditory fibers with electrical stimulation of the cochlea. Hearing Research. 13 (1), 47-62 (1984).
- Sato, M., Baumhoff, P., Kral, A. Cochlear Implant Stimulation of a Hearing Ear Generates Separate Electrophonic and Electroneural Responses. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 54-64 (2016).
- Pfingst, B. E., Spelman, F. A., Sutton, D. Operating ranges for cochlear implants. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 89 (2), (1980).
- Miller, C. A., Hu, N., Zhang, F., Robinson, B. K., Abbas, P. J. Changes across time in the temporal responses of auditory nerve fibers stimulated by electric pulse trains. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 9 (1), 122-137 (2008).
- Shepherd, R. K., Javel, E. Electrical stimulation of the auditory nerve. I. Correlation of physiological responses with cochlear status. Hearing Research. 108 (1-2), 112-144 (1997).
- Akil, O., Oursler, A. E., Fan, K., Lustig, L. R. Mouse Auditory Brainstem Response Testing. Bio Protocol. 6 (6), (2016).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 8 (Unit 8.21B. , (2006).
- TDT. . ABR User Guide: A Guide to ABR Testing with the System 3 RZ6. , (2017).
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Cushing, S. L., Papsin, B. C., Gordon, K. A. Incidence and characteristics of facial nerve stimulation in children with cochlear implants. Laryngoscope. 116 (10), 1787-1791 (2006).
- Berrettini, S., Vito, D. A., Bruschini, L., Passetti, S., Forli, F. Facial nerve stimulation after cochlear implantation: our experience. Acta Otorhinolaryngologica Italica. 31 (1), 11-16 (2011).
- Hu, H., Kollmeier, B., Dietz, M. Reduction of stimulation coherent artifacts in electrically evoked auditory brainstem responses. Biomedical Signal Processing and Control. 21, 74-81 (2015).
- Wiegner, A., Wright, C. G., Vollmer, M. Multichannel cochlear implant for selective neuronal activation and chronic use in the free-moving Mongolian gerbil. Journal of Neuroscience Methods. 273, 40-54 (2016).
- Hessel, H., et al. Meriones unguiculatus (Gerbil) as an animal model for the ontogenetic cochlear implant research. American Journal of Otolaryngology. 18 (S21), (1997).
- Pinilla, M., Ramirez-Camacho, R., Jorge, E., Trinidad, A., Vergara, J. Ventral approach to the rat middle ear for otologic research. Otolaryngology Head Neck Surgery. 124 (5), 515-517 (2001).
- King, J., Shehu, I., Roland, J. T., Svirsky, M. A., Froemke, R. C. A physiological and behavioral system for hearing restoration with cochlear implants. Journal of Neurophysiology. 116 (2), 844-858 (2016).
- Lu, W., Xu, J., Shepherd, R. K. Cochlear implantation in rats: a new surgical approach. Hearing Research. 205 (1-2), 115-122 (2005).
- Poirrier, A. L., et al. Ototoxic drugs: difference in sensitivity between mice and guinea pigs. Toxicology Letters. 193 (1), 41-49 (2010).
- Wu, W. J., et al. Aminoglycoside ototoxicity in adult CBA, C57BL and BALB mice and the Sprague-Dawley rat. Hearing Research. 158 (1-2), 165-178 (2001).
- Taylor, R. R., Nevill, G., Forge, A. Rapid hair cell loss: a mouse model for cochlear lesions. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 9 (1), 44-64 (2008).
