Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris
Summary
Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals suivies par séquençage de RNA unicellulaires. Cette méthode permet des analyses du développement de la lignée endocrine du pancréas, de la cellule hétérogénéité et transcriptomique dynamique.
Abstract
Les cellules endocrines du pancréas, qui sont regroupées en îlots, réglementent la stabilité de glucose de sang et le métabolisme énergétique. Les types cellulaires distincts dans les îlots, y compris les cellules sécrétrices d’insuline β, sont distinguent des progéniteurs endocriniens communes durant le stade embryonnaire. Cellules endocrines immatures étendre via la prolifération cellulaire et mûrissent durant une période de développement longtemps après la naissance. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces processus ne sont pas clairement définis. Unicellulaire RNA-sequencing est une approche prometteuse pour la caractérisation de populations cellulaires distincts et voies de différenciation lignée suivi cellulaire. Nous décrivons ici une méthode pour la cellule unique RNA-séquençage des cellules β du pancréas isolé du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals.
Introduction
Le pancréas est un organe vital métabolique chez les mammifères. Le pancréas est composé de compartiments endocrines et exocrines. Les cellules endocrines du pancréas, y compris les cellules productrices d’insuline β et cellules productrices de glucagon α, cluster ensemble dans les îlots de Langerhans et coordonnée de réguler l’homéostasie du glucose systémique. La dysfonction des cellules endocrines entraîne dans mellitus de diabète, qui est devenue un enjeu majeur de santé publique dans le monde entier.
Les cellules endocrines du pancréas sont dérivés de Ngn3+ progéniteurs au cours de l’embryogenèse1. Plus tard, durant la période périnatale, les cellules endocrines prolifèrent aux îlots immatures de forme. Ces cellules immatures continuent de développer et de devenir progressivement des îlots matures, qui deviennent richement vascularisés pour réguler l’homéostasie du glucose de sang dans les adultes,2.
Bien qu’un groupe de facteurs de transcriptionnelles a été identifié qui régulent la différenciation des cellules β, la voie précise de la maturation des cellules β est encore incertaine. En outre, le processus de maturation des cellules β comporte également la régulation de la cellule numéro expansion3,4 et la génération de l’hétérogénéité cellulaire5,6. Cependant, les mécanismes de régulation de ces processus n’ont pas été bien étudiées.
Unicellulaire RNA-sequencing est une approche puissante qui peut profil sous-populations de cellules et tracer cell lineage voies développementales7. Profitant de cette technologie, la clé des événements qui se produisent au cours du développement des îlots pancréatiques peuvent être déchiffrés au niveau unicellulaire8. Parmi les protocoles de RNA-sequencing unicellulaires, Smart-seq2 permet la génération d’ADNc pleine longueur avec une sensibilité améliorée et précision et l’utilisation des réactifs types à bas coût9. Puce-seq2 prend environ deux jours pour construire une banque d’ADNc pour séquençage10.
Ici, nous proposons une méthode pour isoler des cellules marquées fluorescence β du pancréas de foetus pour adultes de souris transgéniques Ins1-DP11, à l’aide de la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et analyse de la performance de transcriptomique à la niveau unicellulaire, utilisant la technologie Smart-seq2 (Figure 1). Ce protocole peut être étendu pour analyser les transcriptions de tous les types de cellules endocrines pancréatiques dans les États normales, pathologiques et vieillissement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré une méthode efficace et facile à utiliser pour étudier les profils d’expression unicellulaire des cellules β pancréatiques. Cette méthode pourrait être utilisée pour isoler les cellules endocrines du pancréas embryonnaires, néonatals et postnatals et d’effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires.
L’étape la plus critique est l’isolement des cellules β unique en bon état. Pancréas complètement perfusés répondent mieux…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Centre National pour les Sciences de la protéine, Pékin (Peking University) et le centre de Pékin-Tsinghua le Life Science Computing Platform. Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et technologie de la Chine (2015CB942800), la Fondation National sciences naturelles de Chine (31521004, 31471358 et 31522036) et le financement du centre de Pékin-Tsinghua pour les Sciences de la vie à C.-R.X.
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
References
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